趙敏杰， 鞠成國(guó)， 林桂梅， 張 凡， 賈天柱*

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連116600;2. 遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連116600;3. 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制重點(diǎn)研究室，遼寧 大連116600)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征，以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的異質(zhì)、系統(tǒng)、慢性自身免疫功能障礙疾病，嚴(yán)重影響了人們的身心健康和生活質(zhì)量，目前關(guān)于其具體的病理和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。狗脊作為傳統(tǒng)祛風(fēng)濕中藥，具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)腰膝之功效［1］，對(duì)腎陽(yáng)虛佐劑性關(guān)節(jié)炎(DK-AA)及佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠具有治療作用［2-3］，而且對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹也有一定療效［4］，并通過熱板法、扭體法、毛細(xì)玻管法、斷尾法，從體內(nèi)抗炎和鎮(zhèn)痛兩方面研究了生、燙狗脊的鎮(zhèn)痛作用和治療RA 的效果［5-6］，但對(duì)其體外抗炎作用方面的報(bào)道較少，而且機(jī)制也不明確。

細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)被廣泛應(yīng)用于抗炎作用機(jī)制研究，而本實(shí)驗(yàn)以脂多糖(LPS)刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 為體外抗炎模型，以細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的檢測(cè)總評(píng)分為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步探討狗脊的抗炎作用及其機(jī)制，并對(duì)各炮制品進(jìn)行比較來明確其作用差別，為治療RA 提供科學(xué)依據(jù)和參考，有利于臨床靈活辨別使用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

FA1004B 電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);微量移液槍(美國(guó)Thermol 公司);METTLER AE240 分析天平(十萬分之一，瑞士Mettler公司);Multiskan-MK3 酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司);ZHJH-C1112B 超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司);NIB-100 倒置顯微鏡(寧波永新光學(xué)股份有限公司);MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司);Alpha 1-4 冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Christ 公司);KES-21AS20 電陶爐(深圳市康佳電器有限公司)。

LPS (美國(guó)Sigma-Aldrich 公司);TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、NO、小鼠血清ELISA 試劑盒(上海科興貿(mào)易有限公司);RAW264.7 細(xì)胞株(ATCC)、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Thermo Scientific 公司);水為娃哈哈純凈水。

狗脊飲片采自廣西省河池市，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王冰教授鑒定為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz (L.)J. Sm 的干燥根莖。

2 方法

2.1 狗脊不同炮制品及其含藥培養(yǎng)基的制備

2.1.1 燙狗脊的制備［7］取凈河砂400 g，置于炒制容器內(nèi)，武火(180 ～190 ℃)加熱至滑利狀態(tài)，加入凈狗脊片50 g，翻炒6 min 后取出，即得。

2.1.2 鹽狗脊的制備［8］取凈狗脊片50 g，加入含鹽1 g 的鹽水40 mL，保鮮膜密封，浸潤(rùn)2 h 后武火蒸制3 h，再?；饜灊?rùn)4 h，取出干燥，即得。

2.1.3 蒸狗脊的制備 取凈狗脊片50 g，加入清水40 mL，保鮮膜密封，浸潤(rùn)1 h 后放入鍋內(nèi)，武火蒸制4 h，再停火悶潤(rùn)4 h，取出干燥，即得。

2.1.4 酒狗脊的制備［9］取黃酒7.5 g，稀釋至40 mL，加入凈狗脊片50 g 拌勻，保鮮膜密封，浸潤(rùn)2 h 后放入鍋內(nèi)，武火蒸制4 h，再?；饜灊?rùn)4 h，取出干燥，即得。

2.1.5 狗脊各炮制品水煎液的制備 取“2.1.1”～“2.1.4”項(xiàng)下炮制品適量，分別加入10 倍量水煎煮，每次1 h，煎煮3 次，合并濾液，濃縮至相當(dāng)于生飲片質(zhì)量濃度為20 g/L 的溶液，冷凍干燥，再用DMEM 培養(yǎng)基配制相當(dāng)于生藥濃度為20 μg/mL的溶液，即得。

2.2 RAW264.7 細(xì)胞的培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 抗炎作用的測(cè)試方法 ELISA 法測(cè)定細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 以及炎性介質(zhì)PGE2和NO 的濃度，然后刮取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞，以4 ×105個(gè)/mL 的細(xì)胞密度接種于96 孔板上，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基以使周期同步化，培養(yǎng)24 h 后吸取，然后加入狗脊的不同炮制品(生狗脊、燙狗脊、鹽狗脊、蒸狗脊、酒狗脊)和含LPS(終質(zhì)量濃度為1 mg/L)的混合液100 μL，設(shè)置LPS 模型組和空白對(duì)照組(加入DMEM 無血清培養(yǎng)基100 μL)，每組6 個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后，通 過 小 鼠 TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、NO 的ELISA 試劑盒，對(duì)其濃度分別進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用單因素方差分析，SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

3 結(jié)果

3.1 各炮制組對(duì)LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞合成的炎性細(xì)胞因子及介質(zhì)的影響 與空白組比較，模型組LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞合成的炎性細(xì)胞因子及介質(zhì)的量均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。另外，與模型組比較，各炮制組細(xì)胞上清液中這些物質(zhì)的量均明顯降低，具有顯著性差異(P ＜0.05)，見表1。

3.2 狗脊各炮制組抗炎作用機(jī)制指標(biāo)總評(píng)分 根據(jù)作用機(jī)制指標(biāo)的單因素方差分析結(jié)果，對(duì)狗脊各炮制組進(jìn)行評(píng)分，最接近對(duì)照組者計(jì)5 分，次之計(jì)4 分，以此類推，最接近模型組者計(jì)1 分，結(jié)果見表2。由表可知，總評(píng)分由高到低，依次為生狗脊(22 分) ＞燙狗脊(18 分) ＞酒狗脊(15 分) ＞鹽狗脊(12 分) ＞蒸狗脊(9 分)。

表1 各炮制組對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞合成炎性細(xì)胞因子及介質(zhì)的影響(±s，n=6)Tab.1 Effects of all processed groups on LPS stimulated RAW264.7 cells at the levels of inflammatory cytokines and mediators (±s，n=6)

表1 各炮制組對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞合成炎性細(xì)胞因子及介質(zhì)的影響(±s，n=6)Tab.1 Effects of all processed groups on LPS stimulated RAW264.7 cells at the levels of inflammatory cytokines and mediators (±s，n=6)

注:與對(duì)照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 IL-1β IL-6 TNF-α PEG2 NO對(duì)照組 35.571 ±0.998## 59.343 ±1.637## 222.212 ±4.856## 191.600 ±10.205## 24.468 ±1.387##模型組 66.120 ±1.729＊＊ 107.938 ±1.072＊＊ 423.035 ±7.418＊＊ 340.798 ±13.361＊＊ 54.435 ±0.524＊＊生狗脊 38.452 ±1.729* ## 72.564 ±2.144＊＊## 285.443 ±4.856＊＊## 227.229 ±13.361＊＊## 28.706 ±0.908＊＊##鹽狗脊 53.430 ±0.998＊＊## 88.643 ±3.865＊＊## 311.343 ±7.418＊＊## 233.910 ±6.680＊＊## 37.181 ±2.285＊＊##蒸狗脊 56.321 ±0.998＊＊## 76.852 ±2.144＊＊## 309.724 ±4.856＊＊## 309.622 ±7.714＊＊## 45.052 ±0.908* ##燙狗脊 47.099 ±1.729＊＊## 58.990 ±1.637## 236.881 ±4.856＊＊## 249.498 ±10.205＊＊## 27.192 ±0.524＊＊##酒狗脊 46.522 ±0.998＊＊## 77.5664 ±1.637＊＊## 220.694 ±2.807# 256.178 ±10.205＊＊## 34.154 ±0.908＊＊##

表2 各炮制組的作用機(jī)制評(píng)分Tab.2 Scores of mechanisms of action of all processed groups

4 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活動(dòng)期多屬濕熱痹范疇，而炎癥是痹癥的主要病理反應(yīng)之一。由于狗脊作為傳統(tǒng)中藥，具有祛風(fēng)濕功效，因此本實(shí)驗(yàn)從炎性因子和介質(zhì)靶點(diǎn)作用兩方面選取相應(yīng)檢測(cè)指標(biāo)，用于深入探討其作用機(jī)制。炎癥是機(jī)體對(duì)外來刺激產(chǎn)生的一種病理反應(yīng)過程，其癥狀表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛，病理檢查可發(fā)現(xiàn)有大量炎癥細(xì)胞(如粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)的局部浸潤(rùn)和組織壞死。在此過程中，一些細(xì)胞因子起著重要的促進(jìn)作用，而IL-1、IL-6、TNF-α 是介導(dǎo)炎癥的主要細(xì)胞因子，可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集和活化，以及炎癥介質(zhì)的釋放，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)作時(shí)，就可檢測(cè)到上述細(xì)胞因子的水平升高，并在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎局部和全身免疫反應(yīng)中起到重要作用。IL-1β 是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨破壞最重要的一種細(xì)胞因子，在類風(fēng)濕血管翳的形成中具有關(guān)鍵性影響，因此稱其為“中心犯罪”。TNF-α 可刺激滑膜和軟骨細(xì)胞合成PEG2及膠原酶，并引起骨和軟骨細(xì)胞破壞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生;IL-6 既能增強(qiáng)滑膜纖維細(xì)胞尿激酶型纖維，也能促進(jìn)其抑制因子(PAI-1)和金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)的形成，故在關(guān)節(jié)破壞和修復(fù)中占有重要作用;PGE2和NO 是重要的炎性介質(zhì)，其中PGE2具有致熱和致痛作用，是參與滑膜關(guān)節(jié)周圍組織的炎癥、軟骨破壞及增生等病變的主要炎性介質(zhì)，而NO 則可通過增加局部血流，促進(jìn)血漿滲出和水腫形成。因此，選擇IL-1、IL-6、TNF-α、PGE2、NO 作為抗炎指標(biāo)對(duì)于“祛風(fēng)濕”這一功效具有一定代表性。

在炎癥反應(yīng)中，LPS 激活的RAW264.7 模型被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)各物質(zhì)的抗炎作用，其中LPS 是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的毒性物質(zhì)，在與RAW264.7 的Toll 受體結(jié)合后，能激活巨噬細(xì)胞，使其釋放出多種能誘導(dǎo)炎癥發(fā)生的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，并且IL-1、IL-6、TNF-α、PGE2、NO 均可由其產(chǎn)生。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇LPS 刺激單核巨噬細(xì)胞為體外抗炎模型［10-15］。

經(jīng)上述分析及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了IL-6 TNF-α 以及IL-1 NO 和PGE2這一整條炎癥形成的信號(hào)通路，但僅從炎性因子角度考慮狗脊的祛風(fēng)濕功效，就類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎這一痹癥來說還不夠完善，因?yàn)槠洳∫蚝筒C(jī)比較復(fù)雜，而狗脊治療的作用效果體現(xiàn)在各個(gè)環(huán)節(jié)，作用強(qiáng)度不等。如果按照對(duì)炎性細(xì)胞因子的影響劃分，則生狗脊和燙狗脊的抗炎作用最好，其次是酒狗脊、蒸狗脊、鹽狗脊;如果按照對(duì)炎性介質(zhì)的影響劃分，則依次為生狗脊＞鹽狗脊＞燙狗脊＞酒狗脊＞蒸狗脊;如果按照作用機(jī)制指標(biāo)的總評(píng)分劃分，則依次為生狗脊＞燙狗脊＞酒狗脊＞鹽狗脊＞蒸狗脊。其中，在炮制方法方面，生狗脊抗炎效果最好;在加熱方式方面，干熱砂燙法優(yōu)于濕熱水蒸法;在輔料方面，黃酒優(yōu)于食鹽。本實(shí)驗(yàn)通過綜合評(píng)分，篩選出生狗脊抗炎效果最強(qiáng)，符合“生狗脊以祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)為主，制品以補(bǔ)肝腎、強(qiáng)腰膝為主”這一傳統(tǒng)炮制理論。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:95.

［2］ 李 軍，王振海，王春田，等. 狗脊及其炮制品對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血液流變學(xué)的影響［J］. 中國(guó)中藥雜志，2008，33(17):2170-2173.

［3］ 王振海. 中藥狗脊治療腎陽(yáng)虛佐劑性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究［D］. 沈陽(yáng):遼寧中醫(yī)學(xué)院，2005.

［4］ 李 軍，賈天柱，鞠成國(guó)，等. 狗脊對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響［C］ //中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)第四屆中藥炮制分會(huì)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集. 北京:中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥炮制分會(huì)，2004.

［5］ 索天嬌，韓 蕾，賈天柱. 狗脊生、制品不同提取部位抗炎藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究［J］. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30(12):2754-2756.

［6］ 鞠成國(guó)，李 軍，賈天柱. 狗脊及其炮制品和狗脊毛鎮(zhèn)痛、止血作用的實(shí)驗(yàn)研究［C］ //中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)第四屆中藥炮制分會(huì)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集. 北京:中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥炮制分會(huì)，2004.

［7］ 解世全，鞠成國(guó)，賈天柱. 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選狗脊炮制工藝［C］ //中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)第六屆中藥炮制學(xué)術(shù)會(huì)議論文集.北京:中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥炮制分會(huì);淄博:山東鼎立中藥材科技有限公司，2006.

［8］ 中華人民共和國(guó)藥政管理局. 全國(guó)中藥炮制規(guī)范［M］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，1988:71.

［9］ 徐 鋼，鞠成國(guó)，周遠(yuǎn)征，等. 正交試驗(yàn)優(yōu)選酒制狗脊的炮制工藝［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(6):15-18.

［10］ 何 健. 雪膽素甲對(duì)脂多糖活化的巨噬細(xì)胞RAW264.7 的炎癥反應(yīng)的影響及其機(jī)制研究［D］. 廣州:暨南大學(xué)，2013.

［11］ 陳紅光. 含氫培養(yǎng)液對(duì)脂多糖致RAW264.7 巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響［D］. 天津:天津醫(yī)科大學(xué)，2013.

［12］ 徐旋里. 甘露糖對(duì)急性肺損傷的保護(hù)作用及其通過甘露糖受體抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥［D］. 杭州:浙江大學(xué)，2008.

［13］ 萬敬員，葉篤筠，吳 萍，等. 川芎嗪對(duì)脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞環(huán)氧化酶-2 表達(dá)和心肌細(xì)胞凋亡的影響［J］. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，24(10):906-911.

［14］ 劉 卓，隋海娟，閆恩志，等. 知母皂苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放影響［J］. 中國(guó)公共衛(wèi)生，2013，29(3):384-386.

［15］ 關(guān) 爽. 紅景天苷的抗炎作用及其對(duì)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控［D］. 長(zhǎng)春:吉林大學(xué)，2011.