曹曉鋼， 王 君， 李建民， 王順芝

(西藏出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，西藏拉薩850002)

冬蟲夏草是麥角菌科蟲草屬真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis 寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科蝠蛾屬幼蟲上所形成的蟲生子囊真菌，其中西藏冬蟲夏草生長于海拔3 600 米以上，處在晝夜溫差大、紫外線強的嚴寒地帶。因此，這造就了其生物活性物質(zhì)多、藥效強、無污染等特點，是蟲草中的上品，市場地位和名聲很高，有“黃金草”的美譽。

王鋼力等［1］考察了17 批青海和西藏(冬蟲夏草主產(chǎn)地)產(chǎn)冬蟲夏草藥材的質(zhì)量，并采用原子吸收分光光度法測定了其中砷、汞、銅、鉛和鎘的殘留量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些藥材中砷的含有量較高，10 批青海產(chǎn)的砷含有量為3.68 ～9.97 mg/kg，而7批西藏產(chǎn)的為1.16 ～4.40 mg/kg，均明顯超出《中國藥典》2005 年版(一部，2010 年版無)對藥材及其制劑的要求(重金屬As 殘留限量≤2.0 mg/kg)。

目前，人們已發(fā)現(xiàn)30 余種砷形態(tài)化合物。一般認為，無機砷As (V)和As (Ⅲ)的毒性最大，而有機砷中僅MMA 和DMA 有較小的毒性，其他大多無毒［2-5］。由此可見，以無機砷與有機砷的不同毒性進行綜合考察，比用砷的總量來評價其毒性更加科學，因為其總量很可能遠大于砷作為有害污染物的限量。本實驗將建立西藏冬蟲夏草中砷形態(tài)化合物As (Ⅲ)、DMA、MMA 和As (Ⅴ)的高效液相色譜-氫化物產(chǎn)生-原子熒光(HPLC-HGAFS)分析方法，用于測定以上4 種成分的含有量。

1 材料

1.1 儀器 BT 224S 電子天平(德國賽多利斯公司);SAP 10-SA 10 HPLC-HG-AFS 聯(lián)用儀(北京吉天儀器有限公司);KQ300DE 超聲波提取儀(昆山超聲儀器有限公司);Universal 320R 臺式高速離心機(德國Hettich 公司);超純水系統(tǒng)(去離子水電阻率為18.2 MΩ/cm，美國Millipore 公司)。

1.2 標準溶液和試劑 砷標準溶液(1 000 mg/L，國家標準物質(zhì)研究中心);亞砷酸根、砷酸根、一甲基砷、二甲基砷標準溶液(以砷計，質(zhì)量分數(shù)分別為75.7 ±1.2、17.5 ±0.4、25.1 ±0.8、52.9±1.8 μg/g，中國計量科學研究院)。甲醇和硝酸分別為色譜純和優(yōu)級純(德國CNW 公司);硼氫化鉀、氫氧化鈉、硫脲、抗壞血酸均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司);鹽酸為優(yōu)級純(成都市科龍化工試劑廠);其他試劑均為分析純;實驗用水為自制。

1.3 試藥 本實驗共收集了32 批樣品，有29 批在西藏冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)現(xiàn)場采購和市售。其中，21批采自那曲地區(qū)(主產(chǎn)區(qū))，4 批采自林芝地區(qū)，1批采自昌都地區(qū)，3 批采自日喀則地區(qū)。另外剩余3 批樣品采青海和四川省，見表1。

新鮮的冬蟲夏草樣品取回后，去除泥沙，清洗干凈，自然風干至水分含有量在10%以下。然后，將樣品粉碎，裝入密封袋中，置于冰箱保鮮室儲藏備用(除特別說明外，本實驗均采用26 號丁青產(chǎn)冬蟲夏草作為供試樣品)。

2 方法

2.1 儀器參數(shù)與色譜條件 原子熒光分光光度計，負高壓285 V;燈電流100 mA;輔陰極燈電流45 mA;載氣(Ar)體積流量400 mL/min;輔助氣(Ar)體積流量600 mL/min。HPLC 色譜柱，保護柱PRP-X100 (25 mm×2.3 mm，12 ～20 μm);陰離子分離柱PRP-X100 (250 mm × 4.1 mm，10 μm);流動相 (NH4)2HPO4溶液 (20 mmol/L，10% 甲酸調(diào)節(jié)至pH 為6.0);體積流量1.0 mL/min;進樣量100 μL;柱溫30 ℃。

表1 供試樣品列表Tab.1 List of tested samples

2.2 標準溶液的制備 精密稱取亞砷酸根、砷酸根、一甲基砷和二甲基砷標準溶液適量，用純水分別配制成2.0 mg/L 的砷形態(tài)單標，4 ℃下保存。然后，將其用水稀釋成每1 mL 分別含砷20、40、60、80、100 ng 的混合標準溶液，即得。

2.3 樣品的處理 精密稱取樣品0.5 g，置于50 mL 離心管中，加入純水10 mL 混勻，超聲20 min(功率80%、溫度20 ℃)，離心10 min (溫度10 ℃、轉(zhuǎn)速9 000 r/min)，取上清液。然后，再離心10 min (溫度10 ℃、轉(zhuǎn)速16 000 r/min)，取上清液，過0.22 μm 濾膜，濾液(4 ℃下保存時間不超過48 h)進行HPLC-HG-AFS 分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

3.1.1 色譜柱的選擇 4 種砷形態(tài)化合物As(Ⅲ)、DMA、MMA 和As (Ⅴ)均為中強酸或弱酸性，根據(jù)它們在一定介質(zhì)中能以陰離子形式存在的特點，并參考文獻［6-9］，本實驗采用Hamilton PRP-X100 陰離子分析色譜柱，能較好地分離無機和有機陰離子。

3.1.2 流動相的選擇

3.1.2.1 流動相體系［10-13］本實驗分別對磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二銨作為流動相進行考察，發(fā)現(xiàn)以20 mmol/L K2HPO4和20 mmol/L KH2PO4混合溶液(pH = 6.0)為流動相時，As(Ⅲ)、DMA 和MMA 不能完全分離;以10 mmol/L K2HPO4和10 mmol/L KH2PO4混合液(pH =6.0)為流動相時，4 種砷形態(tài)化合物能完全分離，但As(Ⅴ)峰形不理想;以15 mmol/L 磷酸氫二銨(pH=6.0)為流動相時，As (Ⅴ)峰形也不理想，當濃度為25 mmol/L 時，DMA 和MMA 峰靈敏度降低較多，但當濃度為20 mmol/L 時，以上4 種成分能完全分離，而且峰形尖銳，靈敏度高。因此，選擇20 mmol/L 磷酸氫二銨作為流動相體系。

3.1.2.2 流 動 相 pH［14］以 20 mmol/L(NH4)2HPO4為流動相，考察了不同pH (5.0、6.0、7.0)下4 種砷形態(tài)化合物的分離情況。結(jié)果顯示，當pH 小于6.0 時，As (Ⅲ)與DMA 不易分離;當pH 大于6.0 時，DMA 與MMA 也難以分離。因此，選擇流動相的pH 為6.0。

3.1.2.3 體積流量 流動相的體積流量與分離柱的填料性質(zhì)、顆粒粒徑大小等因素有關(guān)，結(jié)合柱色譜類型與要求，本實驗在0.8 ～1.5 mL/min 之間選擇。結(jié)果，從譜圖的分離效果、峰型等指標來看，當體積流量為1.0 mL/min 時，4 種砷形態(tài)的分離效果最好。

3.2 原子熒光條件的優(yōu)化

3.2.1 KBH4濃度的選擇 KBH4可影響氫化物生成和氫火焰質(zhì)量，對分析結(jié)果的影響很大。本實驗顯示，適宜的KBH4濃度為1.5%。

3.2.2 HCl 濃度的選擇 HCl 濃度過高，將生成過量的氫氣，易導致信噪比小，重現(xiàn)性低;HCl 濃度過低，三價砷的還原將不完全，同時不能產(chǎn)生有效的火焰。因此，本實驗選擇HCl 濃度為7%。

3.2.3 蠕動泵轉(zhuǎn)速的確定 蠕動泵轉(zhuǎn)速主要決定KBH4和HCl 的進樣濃度，當轉(zhuǎn)速為60 r/min 時，砷形態(tài)檢測信號達到最佳情況。因此，本實驗選擇蠕動泵轉(zhuǎn)速為60 r/min。

3.3 前處理條件的優(yōu)化［15-18］

3.3.1 提取溶劑的選擇 砷化合物的提取是定量分析的關(guān)鍵，本實驗考察了純水、磷酸氫二銨-水(0.26%，m/V)、磷酸氫二鉀-水(0.5%，m/V)、磷酸-水(2%，V/V)、鹽酸-水(2%，V/V)、甲醇-水(20%，V/V)這6 種體系的提取效果。結(jié)果顯示，采用純水提取時，提取率較高，而且色譜峰的分離度較好。因此，本實驗選擇純水為提取溶劑。

3.3.2 提取參數(shù)的選擇 通過正交試驗優(yōu)化，本實驗確定最佳的提取參數(shù)為料液比0.5 g ∶10 mL，超聲功率80%，提取時間20 min，提取溫度20 ℃。

3.3.3 離心條件的選擇 離心條件主要為離心速度、溫度和時間。本實驗發(fā)現(xiàn)，較好的離心條件為離心10 min (溫度10 ℃、轉(zhuǎn)速9 000 r/min)，取上清液，再離心10 min (溫度10 ℃、轉(zhuǎn)速16 000 r/min)。

3.4 方法學考察

3.4.1 線性關(guān)系和檢出限 0 ～100 μg/L 范圍內(nèi)配制質(zhì)量濃度為0、20、40、60、80 和100 μg/L的4 種砷形態(tài)化合物混合標準溶液，然后以化合物的峰面積為縱坐標(S)，相應的質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(C)，繪制標準工作曲線。結(jié)果，在0 ～100 μg/L 范圍內(nèi)，它們均呈良好的線性關(guān)系，r均＞0.999。再根據(jù)儀器3 倍信噪比(3 S/N)，計算出砷形態(tài)檢出限，見表2。

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限Tab.2 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges and limits of detection

3.4.2 回收率及精密度 本實驗對同一冬蟲夏草樣品分別加入高、中、低3 個水平的對照品，每個水平重復6 次，計算回收率及同一水平的RSD 值，結(jié)果見表3。由表可知，該方法對冬蟲夏草樣品的加樣回收率在87.0% ～94.0%之間，檢測結(jié)果間的RSD 值在1.0% ～4.5%之間，顯示出良好的回收率和精密度。

表3 冬蟲夏草中砷形態(tài)的回收率和精密度(n=6)Tab.3 Recovery rates and precisions of arsenic speciations in Cordyceps sinensis (n=6)

3.4.3 穩(wěn)定性考察［19］實驗中發(fā)現(xiàn)，40 ℃下水浴48 h 時，會導致As (Ⅲ)迅速降解，僅有一小部分轉(zhuǎn)化為As (V)，而DMA 和MMA 則較為穩(wěn)定。因此，其前處理方法應簡便、快速，經(jīng)處理后的樣品溶液不宜長時間置于室溫下，否則很容易造成As (Ⅲ)降解，并且還應盡快上機測定，于4 ℃下保存的時間不宜超過48 h。

3.5 樣品測定 為進一步研究樣品中的砷形態(tài)，本實驗采用《GB/T 5009.11-2003 食品中總砷和無機砷的測定》中的方法，測定了32 批樣品的總砷、無機砷和有機砷含有量，結(jié)果見表4。由表可知，西藏冬蟲夏草中總砷的含有量在4.71 ～8.91 mg/kg 之間，明顯超出《中國藥典》及《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》中有害元素砷限量指標≤2.0 mg/kg 的規(guī)定。但是，該植物中的無機砷主要以As (Ⅲ)形態(tài)存在，含有量較低，在0.01 ～0.06 mg/kg 之間，而且As (V)形態(tài)含有量也非常低，僅檢出2 批，分別為0.015 和0.020 mg/kg，同時有機砷中的DMA 和MMA 也均未檢出。由此說明，西藏冬蟲夏草中的總砷主要以其他有機砷形態(tài)存在，并且四川和青海產(chǎn)冬蟲夏草與西藏產(chǎn)在砷形態(tài)含有量方面無明顯差異。

4 結(jié)論

本實驗建立了一種HPLC-HG-AFS 聯(lián)用技術(shù)分析西藏冬蟲夏草中砷形態(tài)化合物As (Ⅲ)、DMA、MMA、As (V)的方法，并確定了液相色譜、原子熒光以及樣品前處理的條件。結(jié)果表明，該方法能有效分析測定西藏冬蟲夏草中的砷形態(tài)化合物，以上4 種成分的加樣回收率較高，在87.0% ～94.0%之間，而且分離效果良好，操作簡便快速，靈敏度高，重復性好，測定結(jié)果準確可靠。

表4 冬蟲夏草中砷形態(tài)檢測結(jié)果Tab.4 Determination result of arsenic speciations in Cordyceps sinensis

另外還發(fā)現(xiàn)，西藏冬蟲夏草中總砷的含有量較高，但毒性較大的無機砷含有量較低，而且毒性較小的DMA 和MMA 也未檢出，大部分以其他有機砷形態(tài)存在?！禛B 2762-2012 食品安全國家標準食品污染物限量》中對無機砷的最高限量為0.1 mg/kg，可見該植物中的無機砷含有量符合最嚴格的食品安全標準，危害性較小。但是，西藏冬蟲夏草中的有機砷是以何種形態(tài)存在，其毒性大小如何，還需要進行深入的研究。

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