李 想， 盧靜華

(遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州121000)

加味香連丸收載于《中國藥典》2010 年版一部，由黃柏、木香、黃芩、黃連、枳殼、白芍、當(dāng)歸、厚樸、檳榔、延胡索、吳茱萸、甘草12 味中藥組成，具有清熱祛濕、化滯止痛的作用。臨床主要用于大腸濕熱所致的痢疾，癥見大便膿血、腹痛下墜、里急后重［1］。其中芍藥、黃芩和枳殼均為主要藥味。白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽，用于血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)、自汗、盜汗、脅痛、腹痛、四肢攣痛、頭痛眩暈［2］。芍藥苷是白芍的主要成分之一。黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血、除熱安胎等功效，用于濕熱瀉痢、肺熱咳嗽、熱病煩渴、黃疸、目赤腫痛、積熱吐血、胎動不安等癥［3-6］。黃芩苷是黃芩的主要成分之一。枳殼有理氣寬中、行滯消脹的功能，主要用于胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停、臟器下垂［7-11］。柚皮苷、橙皮苷是枳殼的主要成分。目前《中國藥典》2010 年版只收載了高效液相色譜法測定加味香連丸中鹽酸小檗堿的含有量。為滿足對復(fù)雜中成藥質(zhì)量控制要求，本實驗選取了芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷和黃芩苷作為檢測指標(biāo)，建立高效液相同時測定這4 種成分的方法以有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 KQ-100A 型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);L-2000 高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器(日本日立公司);無油真空泵(上?？茽栠_制泵有限公司);YOKO-ZF 三用紫外分析儀(武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司);TD 型電子天平(德國賽多利斯股份公司);1810-B 型石英自動雙重水蒸餾器(江蘇宏華儀器廠)。

1.2 試藥 對照品柚皮苷(批號110722-201108)、黃芩苷 (批號110715-201104)、橙皮苷 (批號11021-201212)均購自中國食品藥品檢定研究院。加味香連丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號分別為2083019、4082033、3081091)。甲醇、乙腈均為色譜純;磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用 Hypersil ODS 色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm);以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)為流動相，梯度洗脫 (0 ～20 min，10% ～15% A;20 ～30 min，15% ～20% A;30 ～50 min，20% ～22% A;50 ～55 min，22% ～23% A);體積流量1.0 mL/min;檢測波長274 nm;柱溫25 ℃;進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取適量加味香連丸，置于研缽中研成細粉，精密稱定約0.2 g 粉末，置于錐形瓶中。加入50 mL 甲醇，密閉條件下放置24 h，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，減失質(zhì)量用甲醇補足，搖勻，抽濾，用0.45 μm 的濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得［12-14］。

2.2.2 混合對照品貯備液的制備 分別取芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷和黃芩苷0.80 mg、5.2 mg、1.7和3.3 mg，精密稱定，置于同一25 mL 量瓶中，加入適量甲醇并定容，搖勻，制得質(zhì)量濃度分別為0.032、0.208、0.068、0.132 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按原處方制備不含白芍藥材、枳殼藥材和黃芩藥材的陰性樣品，并按“2.2.1”項下制備工藝分別制成不含芍藥、麩炒枳殼和黃芩的陰性供試品及陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積，芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷和黃芩苷的峰與其他峰均可達到基線分離，樣品中其他成分不干擾測定，保留時間適中，見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、1.2、2.4 mL“2.2.2”項下的混合對照品貯備液，分別置于不同的10 mL 量瓶中，加入甲醇定容。在“2.1”項下色譜條件進樣分析，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，計算線性回歸方程，得到芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷和黃芩苷的回歸方程分別為Y = 1.12 × 104X +0.59 ×103(r =0.999 8)，線性范圍0.32 ～7.68 μg/mL;Y=1.26 ×104X+6.62 ×103(r=0.999 8)，線性范圍2.08 ～49.92 μg/mL;Y =1.34 ×104X +1.88 ×103(r =0.999 7)，線性范圍0.68 ～16.32 μg/mL;Y=2.35 ×104X-1.02 ×104(r=0.999 8)，線性范圍1.32 ～31.68 μg/mL。

圖1 加味香連丸中芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of paeoniflorin，naringin，hesperidine and baicalin in Jiawei Xianglian Pills

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 重復(fù)性試驗 取同一供試品溶液(n =6)，在“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷和黃芩苷色譜峰面積的RSD 分別為0.92%、0.76%、0.84% 和1.4%，結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.5.2 精密度試驗 取同一質(zhì)量濃度的混合對照品，在“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，并計算芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷和黃芩苷色譜峰面積的RSD 分別為0.61%、0.37%、0.79%和1.3%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液(批號2083019)，分別于0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”項下色譜條件進樣分析。結(jié)果芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷和黃芩苷的RSD 分別為1.1%、0.64%、0.79%和1.1%，表明樣品中4 種成分在室溫下放置24 h 基本穩(wěn)定。

2.5.4 加樣回收試驗 分別取0.1 g 含有量已知的同一批次(批號2083019)加味香連丸樣品粉末9 份，按低(含芍藥苷0.043 2 mg/mL、柚皮苷0.592 4 mg/mL、橙皮苷0.130 4 mg/mL、黃芩苷0.289 6 mg/mL)、中(含芍藥苷0.054 7 mg/mL、柚皮苷0.7488 mg/mL、橙皮苷0.174 8 mg/mL、黃芩苷0.355 2 mg/mL)、高 (含芍藥苷0.066 2 mg/mL、柚皮苷0.883 6 mg/mL、橙皮苷0.205 6 mg/mL、黃芩苷0.425 4 mg/mL)3 種加入量分別精密加入混合對照品溶液各1 mL，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，測定，計算結(jié)果見表1。

2.6 樣品測定 取本品3 批，按“2.2.1”項下方法操作，制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，用外標(biāo)法計算加味香連丸中芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷和黃芩苷的含有量，結(jié)果見表2。

3 討論

在200 ～400 nm 波長處進行紫外掃描，芍藥苷在230 nm 有最大吸收，柚皮苷和橙皮苷在284 nm處有最大吸收，黃芩苷在274 nm 處有最大吸收，根據(jù)此3 種波長下色譜圖比較，應(yīng)選用274 nm 為檢測波長，分離度較好，干擾小。

采用Hypersil ODS 色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)和Hypersil BDS 色譜柱 (4.6 mm × 200 mm，5 μm)進行試驗，BDS 色譜柱出峰時間較早，但分離度和響應(yīng)度較ODS 色譜柱差，故選用ODS 色譜柱進行測定。

曾選用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸水為流動相，乙腈為流動相時，出峰時間較甲醇早，且前后峰之間的分離度較好。加入0.2%的磷酸水溶液后，前延峰和拖尾峰能得到較好分離，峰形較好。因此選用乙腈-0.2%磷酸水作為流動相。

《中國藥典》2010 年版中收錄了加味香連丸中鹽酸小檗堿的定量測定作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有文獻中也只有對加味香連丸中厚樸、厚樸酚、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯及芍藥苷的測定，而對于含有較多味中藥材的中成藥來說，需要檢測其中多種藥材中成分的含有量以便更好地控制該產(chǎn)品的質(zhì)量。本實驗采用HPLC 法同時測定加味香連丸中芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷和黃芩苷4 種黃酮類成分，方法簡便、可靠、準(zhǔn)確，重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，為加味香連丸的質(zhì)量控制提供了更為可靠的依據(jù)。

表1 加樣回收率測定結(jié)果Tab.1 Result of recovery tests

表2 樣品測定結(jié)果(±s，n=3)Tab.2 Result of determination of samples (±s，n=3)

表2 樣品測定結(jié)果(±s，n=3)Tab.2 Result of determination of samples (±s，n=3)

批號 芍藥苷/(mg·g -1)柚皮苷/(mg·g -1)橙皮苷/(mg·g -1)黃芩苷/(mg·g -1)7 3.57±0.016 1 4082033 0.47±0.005 2 6.69±0.034 1 1.64±0.007 5 3.03±0.025 5 3081091 0.51±0.006 4 7.29±0.031 3 1.77±0.010 2083019 0.55±0.005 0 7.41±0.019 3 1.70±0.003 7 3.96±0.015 0

［1］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:666.

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