李媛媛， 山金鳳， 譚清杰， 蔣建蘭

(天津市生物與制藥工程重點實驗室，天津大學化工學院制藥工程系，天津300072)

真元顆粒是由刺五加、青蒿、葛根、防風、甘草等九味中藥經(jīng)提取加工制成的復方制劑。在臨床上用于輔助腫瘤治療，達到改善腫瘤患者體質(zhì)、提高機體免疫、提高生存質(zhì)量、延長壽命的效果［1］。該制劑已建立了以甘草酸為指標成分進行定量測定的質(zhì)量控制標準，考慮到中藥復方制劑成分的多樣性和復雜性，單一成分作為指標不能準確反映中藥復方制劑質(zhì)量，因而本實驗建立了一種同時測定真元顆粒干浸膏中刺五加和青蒿有效成分綠原酸［2-3］、葛根有效成分葛根素［4］、防風有效成分升麻素苷［5］、甘草有效成分甘草苷和甘草酸的高效液相色譜法［6］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity 型高效液相色譜儀，配四元梯度泵600 bar，超高靈敏度二極管陣列檢測器，半導體控溫柱溫箱，100 位自動進樣器，Chemstation 工作站(美國Agilent 公司);電子天平BSA224S-CW 購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;AS10200 超聲波清洗機(電壓220 V/50 Hz)購自天津奧特賽恩斯儀器有限公司;Eppendorf centrifuge 5804R 型離心機。

1.2 試藥 甘草苷、甘草酸銨、升麻素苷、葛根素、綠原酸對照品(批號分別為111610-201106、110731-201317、 111522-201310、 110752-201313、110753-201314)均購自中國食品藥品檢定研究院;真元顆粒中試干浸膏，中新制藥廠生產(chǎn);中藥復方藥材(安仁中醫(yī)院)。提取用蒸餾水，天津大學自制;無水乙醇為分析純;磷酸為優(yōu)級純;冰醋酸，甲酸，甲醇和乙腈為色譜純;娃哈哈純凈水。藥材由天津藥物研究院張鐵軍研究員鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent SB C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)，梯度洗脫(0 ～5 min，95% B;5 ～43.5 min，95% ～88.5% B;43.5 ～66.5 min，88.5% ～83% B;66.5 ～79 min，83% ～80% B;79 ～80 min，80% ～69%B;80 ～104 min，69% ～58%B);柱溫30 ℃;體積流量1.2 mL/min;檢測波長為250 nm (0 ～43.5 min)，300 nm (43.5 ～66.5 min)，250 nm (66.5 ～104 min);進樣量為10 μL。在上述條件下，樣品中各對照品與其他組分達到基線分離，與相鄰的色譜峰分離度大于1.5。各對照品峰理論塔板數(shù)不小于16 000。

2.2 對照品溶液的配制 分別精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的對照品綠原酸、葛根素、升麻素苷、甘草苷和甘草酸銨 (甘草酸質(zhì)量= 甘草酸銨質(zhì)量/1.020 7)適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為916、780、664、1 900 μg/mL 和900 μg/mL 的各對照品溶液，4 ℃冷藏備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取真元顆粒干浸膏粉末0.200 0 g，置5 mL 量瓶中，加入40%甲醇，密塞，超聲(40 kHz、300 W)處理30 min，放冷至室溫，40%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，過0.45 μm 微孔有機濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性供試品溶液的制備 按真元顆粒處方稱取藥材，按“2.3”項下方法分別制備缺刺五加和青蒿、缺葛根、缺甘草和缺防風的陰性供試品溶液，4 ℃冷藏備用。

2.5 方法學考察

2.5.1 方法專屬性試驗 在“2.1”項色譜條件下，所測5 種有效成分與其他成分色譜峰均可基線分離(分離度大于1.5)，且陰性供試品無干擾。對照品、供試品及陰性供試品色譜圖見圖1。

2.5.2 線性關系的考察 分別精密吸取“2.2”項下各對照品溶液適量，混合定容至25 mL 量瓶中，制成含綠原酸、葛根素、升麻素苷、甘草苷和甘草酸銨質(zhì)量濃度分別為82.4、46.8、19.9、266.0 和576.0 μg/mL 的混合對照品溶液(1)。精密吸取混合對照品溶液(1)3 800、2 500、1 940、1 250、625 μL 分別置于5 mL 量瓶中，加甲醇定容后搖勻，制得混合對照品溶液(2) ～ (6)。取混合對照品溶液(1) ～(6)，按“2.1”項色譜條件記錄色譜圖及峰面積。以峰面積為縱坐標(y)，質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(x)，繪制標準曲線，計算得回歸方程綠原酸y=10.547x+4.293 4 (r=0.999 6);葛根素y=35.382x +19.105 (r =0.999 4);升麻素苷y =12.346x +3.931 9 (r =0.999 7);甘草苷y =8.650 9x +18.898 (r =0.999 6);甘草酸銨y=6.759 6x -72.048 (r =0.999 3)。綠原酸、葛根素、升麻素苷、甘草苷和甘草酸銨分別在10.3 ～82.4 μg/mL、5.9 ～46.8 μg/mL、2.5 ～19.9 μg/mL、33.3 ～ 266.0 μg/mL、72.0 ～ 385.5 μg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關系。

2.5.3 精密度試驗 取混合對照品溶液(3)，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，綠原酸、葛根素、升麻素苷、甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD 值分別為0.85%、0.88%、0.85%、0.78%和0.67%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

圖1 HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.5.4 供試品精密度試驗 取真元顆粒干浸膏粉，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，綠原酸、葛根素、升麻素苷、甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD 值分別為0.53%、0.75%、1.58%、0.17% 和0.13%。結(jié)果表明，供試品溶液制備方法適合甘草酸等5 個成分的HPLC 測定。

2.5.5 重復性試驗 取同一批號真元顆粒干浸膏粉，按“2.3”項下方法制備供試品溶液6 份，分別按“2.1”項下色譜條件測定。綠原酸、葛根素、升麻素苷、甘草苷和甘草酸峰面積的RSD 值分別為1.2%、0.57%、0.71%、1.69%、0.72%。結(jié)果表明，方法重復性良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗 取真元顆粒干浸膏粉，按“2.3”項下方法制備供試品液，于0、2、4、6、12、24 h 按“2.1”項下色譜條件測定。綠原酸、葛根素、升麻素苷、甘草苷和甘草酸5 個化合物峰面積RSD 分別為1.90%、0.74%、1.30%、0.20%和0.25%。結(jié)果表明，在24 h 內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

2.5.7 加樣回收率試驗 精密吸取“2.2”項下各對照品溶液適量，混合定容至25 mL 量瓶中，制成含綠原酸、葛根素、升麻素苷、甘草苷和甘草酸銨分別為48.7、25.2、10.6、130.5 和316.8 μg/mL的混合對照品溶液(7)。取含有量已知的真元顆粒干浸膏約0.1 g，精密稱定，平行制備9 份，每3 份為一組，按高、中、低 (即80%、100%、120%)比例分別精密吸取加入混合對照品溶液(7)，按“2.3”項下方法制備供試品液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

2.6 樣品測定 取3 批不同來源藥材制備的樣品，按“2.3”項下方法制備供試品液，按“2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法考察 實驗中對提取溶劑和超聲時間進行了考察。提取溶劑考察了甲醇、乙醇、80%甲醇、40%甲醇、80%乙醇和40%乙醇，結(jié)果表明40%甲醇配制的供試品溶液，譜峰分離效果最好，色譜峰響應更大，故確定采用40%甲醇配制供試品溶液。超聲時間考察了30、40、50 和60 min 不同時間的提取效果，結(jié)果表明在超聲提取30 min 后綠原酸、葛根素、升麻素苷、甘草苷和甘草酸的量無顯著變化，故選取超聲30 min。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.1 Result of recovery tests

表2 樣品測定結(jié)果(mg/g)Tab.2 Result of determination of samples(mg/g)

3.2 檢測波長的選擇 設定237、250、280 和300 nm 四個波長進行篩選，同時利用高效液相色譜儀中DAD 檢測器的波長掃描功能，進行190 ～400 nm 全波長掃描，得到綠原酸、葛根素、升麻素苷、甘草苷和甘草酸的紫外吸收光譜。綜合來看，250 nm 下各色譜峰均有較大吸收，其中綠原酸峰雖然在320 nm 左右有最大吸收，但因其含有量相對較高，在250 nm 下色譜峰響應已較大，故選定250 nm 為綠原酸的檢測波長;其中升麻素苷和甘草苷色譜峰在250 nm 條件下由于雜峰干擾，分離度太差，經(jīng)多次梯度改變嘗試仍無果，因而考慮在升麻素苷和甘草苷均有較大吸收且效果與250 nm 極其相近的300 nm 下進行檢測。故本實驗利用波長切換，更加有效的進行了多成分定量測定。

3.3 流動相的選擇 參考相關文獻［7-13］，本實驗對乙腈-0.1%醋酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液和乙腈-0.1%甲酸溶液進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1% 甲酸溶液梯度洗脫時，各色譜峰保持良好的峰形，分離度均大于1.5，理論板數(shù)均超過了10 000，并且陰性對照色譜中無干擾峰的出現(xiàn)。故確定流動相組成為乙腈-0.1%甲酸溶液。

3.4 柱溫和體積流量的選擇 本實驗考察25 ℃、30 ℃、35 ℃這3 個不同柱溫的影響，結(jié)果表明25℃和35 ℃下色譜峰分離效果較差，而30 ℃柱溫色譜圖中各色譜峰峰形良好，分離度均符合要求，故確定最佳柱溫為30 ℃。試驗考察了0.8、1.0、1.2 mL/min 這3 個不同體積流量的影響，結(jié)果表明體積流量為0.8 mL/min 和1.0 mL/min 時，部分色譜峰分離效果差，而體積流量為1.2 mL/min時各目標色譜峰的峰形良好，分離度均達到要求，故確定體積流量為1.2 mL/min。

3.5 結(jié)論 本實驗建立HPLC-DAD 同時定量測定真元顆粒干浸膏中綠原酸、葛根素、升麻素苷、甘草苷和甘草酸的方法，針對5 個活性指標成分進行分析，簡便易行，專屬性強，重復性好，準確度高，為真元顆粒質(zhì)量控制提供了科學依據(jù)。

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