張文秀， 朱衛(wèi)豐， 聶鶴云， 吳德智， 陳麗華， 管詠梅

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330004)

馬錢(qián)子又稱番木鱉，為馬錢(qián)科植物馬錢(qián)Strychnos nux-vomica L. 的干燥成熟種子。本品味苦，性溫，有大毒，歸肝、脾經(jīng)，具有通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫功效，臨床上主要用于跌打損傷、骨折腫痛、風(fēng)濕頑痹、麻木癱瘓、癰疽瘡毒、咽喉腫痛［1-2］?，F(xiàn)代藥理研究表面馬錢(qián)子對(duì)中樞系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)均有較強(qiáng)的藥理作用［3-5］。其主要有效成分為總生物堿，士的寧(番木鱉堿)和馬錢(qián)子堿占總生物堿的70% ～80%［6-7］。

Box-Behnken 響應(yīng)面法(response surface methodology，RSM)是統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的合成，利用Box-Behnken 的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到一系列數(shù)據(jù)，采用多元二次方程來(lái)擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法［8］。與以往推廣的正交設(shè)計(jì)法相比，RSM 統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)可以評(píng)價(jià)指標(biāo)和因素間的非線性關(guān)系，使用方便，條件預(yù)測(cè)性好，已廣泛用于化學(xué)合成過(guò)程、藥物處方篩選和劑型制備過(guò)程等的優(yōu)化［9-10］。

前期文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，馬錢(qián)子提取工藝優(yōu)化主要以單因素考察，正交設(shè)計(jì)為主，未發(fā)現(xiàn)Box-Behnken 設(shè)計(jì)用于馬錢(qián)子研究［11-12］。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken 響應(yīng)面法對(duì)乙醇回流提取工藝中影響馬錢(qián)子提取的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，確定操作工藝可行的提取工藝，為后期馬錢(qián)子制劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 Series 高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);KQ5200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);YF-103 高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司);TGL-16G 臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);BS124S 電子天平(德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);ZNHW 型電熱套(鞏義市予華儀器有限公司);PH-3C pH 計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司);HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司);SZ-93 自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

馬錢(qián)子堿對(duì)照品(純度＞98%，中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，批號(hào) M0-20111012);士的寧對(duì)照品(純度＞98%，中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，批號(hào)S0-20130211)。磷酸二氫鉀(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);庚烷磺酸鈉(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司);鹽酸(西隴化工股份有限公司);乙醇(純度為95%，天津市大茂化學(xué)試劑廠);甲醇(美國(guó)天地公司);乙腈(美國(guó)天地公司)。沙燙馬錢(qián)子飲片購(gòu)于南昌市開(kāi)心人大藥房，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室龔千峰教授鑒定為馬錢(qián)科植物馬錢(qián)Strychnos nux-vomica L. 的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 馬錢(qián)子堿、士的寧測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件 采用phenomenex C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);以乙腈-0.01 mol/L 庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L 磷酸二氫鉀等量混合溶液(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH 為2.8)(21 ∶79)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm［1］;柱溫為35 ℃。在此條件下，2 個(gè)生物堿類成分分離度良好，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 馬錢(qián)子藥材和混合對(duì)照品HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms for Strychni Semen and mixed reference substances

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱定馬錢(qián)子堿、士的寧置50 mL 量瓶中，加甲醇超聲溶解后，靜置，甲醇定容至50 mL，配成質(zhì)量濃度分別為0.137、0.142 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液A。精密吸取上述混合對(duì)照品溶液A 1、2、4、6、8 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液B、C、D、E、F。將上述系列混合對(duì)照品溶液保存于4 ℃冰箱中，備用。

2.1.3 供試品溶液制備 取馬錢(qián)子提取液，4 000 r/min 離心10 min，上清液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，精密吸取1 mL 濾液置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下6個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)(峰面積)對(duì)被測(cè)物質(zhì)量作圖，得到各成分的回歸方程及線性范圍。馬錢(qián)子回歸方程為Y =11 827X -2.212 9 (r =0.999 5，線性范圍0.013 7 ～0.137 mg/mL);士的寧回歸方程為Y=17 502X - 19.258 (r = 0.999 6，線性范圍0.014 2 ～0.142 mg/mL)。結(jié)果表明，各對(duì)照品質(zhì)量在一定范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次20 μL，記錄馬錢(qián)子堿和士的寧的峰面積，并計(jì)算各成分峰面積的RSD 值。結(jié)果馬錢(qián)子堿的RSD 為0.6%，士的寧的RSD 為1.1% (n =6)。由于所得RSD 值均小于2%，故該儀器精密度較好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批馬錢(qián)子提取液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算各成分RSD。結(jié)果馬錢(qián)子堿和士的寧RSD 分別為1.3%、1.5% (n=6)，所得RSD 值均小于2%，故該方法重復(fù)性較好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份馬錢(qián)子供試品溶液，分別于溶液制備后的第0、2、4、6、8、10、12、24 及36 h 進(jìn)樣，測(cè)定各成分峰面積RSD 值。結(jié)果馬錢(qián)子堿、士的寧RSD 分別為0.7%，1.2%(n=9)，所得的RSD 值均小于2%，表明36 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取成分含有量已知的馬錢(qián)子提取液1 mL 于10 mL 量瓶中，分別加入相當(dāng)于馬錢(qián)子提取液中馬錢(qián)子堿、士的寧含有量0.8倍、1.0 倍、1.2 倍的馬錢(qián)子堿、士的寧對(duì)照品，加甲醇定容，搖勻。每個(gè)劑量組平行制備3 份進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算各成分的平均加樣回收率及RSD 值。結(jié)果馬錢(qián)子平均加樣回收率為100.35%，RSD 為0.8%;士的寧平均加樣回收率為99.57%，RSD 為1.2% (n=9)，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 馬錢(qián)子提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 液料比考察 取馬錢(qián)子粉末，每份15 g，分別加50% 乙醇6、8、10、12、14 倍，溶液用10%磷酸調(diào)pH 為5.0，煎煮1 h。隨著溶劑量的增加馬錢(qián)子綜合效應(yīng)值先升高后下降，當(dāng)溶劑量增加到12 倍時(shí)綜合效應(yīng)值達(dá)到最大，因此最佳料液比為加入12 倍量的溶劑。

2.2.1.2 提取時(shí)間考察 取馬錢(qián)子粉末，每份15 g，加10 倍量50%乙醇溶液，用10%磷酸調(diào)pH為5.0，不同煎煮時(shí)間(0.5、1、1.5、2 及2.5 h)條件下提取馬錢(qián)子堿和士的寧。隨著提取時(shí)間的增加馬錢(qián)子綜合效應(yīng)值先升高后下降，當(dāng)提取時(shí)間為1.5 h 時(shí)綜合效應(yīng)值達(dá)到最大，因此最佳提取時(shí)間為1.5 h。

2.2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)考察 取馬錢(qián)子粉末，每份15 g，加10 倍量的乙醇溶液，用10%的磷酸調(diào)pH 為5.0，不同乙醇體積分?jǐn)?shù) (40%、50%、60%、70%、80%)條件下提取馬錢(qián)子堿和士的寧。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加綜合效應(yīng)值先升高后下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)綜合效應(yīng)值達(dá)到最大，因此最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.3 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化馬錢(qián)子回流提取工藝

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 文獻(xiàn)和單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，影響馬錢(qián)子回流提取較顯著的因素有乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)、提取時(shí)間和料液比。提取次數(shù)數(shù)據(jù)結(jié)果在模型擬合中，由于處理非連續(xù)變量比較困難，提取次數(shù)暫定為3 次。根據(jù)Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對(duì)各因素進(jìn)行3 水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因子編碼值試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和表2。按其選擇的因素和水平進(jìn)行回流提取，測(cè)定馬錢(qián)子堿和士的寧含有量。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平編碼Tab.1 Factors and the levels of coding for Box-Behnken experimental design

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Box-Behnken design and test result

2.3.2 模型擬合 將所得數(shù)據(jù)用Design-Expert V.8.0.6 軟件進(jìn)行效應(yīng)面試驗(yàn)分析。綜合考慮馬錢(qián)子堿和士的寧的藥效和毒性［6］，以馬錢(qián)子堿含有量的40%、士的寧含有量的60%為綜合效應(yīng)值，分別對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸和二次多項(xiàng)回歸模型擬合，得綜合效應(yīng)= -39.838 76 +3.654 03 ×液料比+1.932 28 ×乙醇體積分?jǐn)?shù)-25.473 74 ×提取時(shí)間- 0.021 919 × 液料比× 乙醇體積分?jǐn)?shù)+1.535 83液料比× 提取時(shí)間- 0.159 20 × (液料比)2-0.020 380 × (乙醇體積分?jǐn)?shù))2-2.379 57 ×(提取時(shí)間)2，該方程的相關(guān)系數(shù)r =0.971 2 表明該回歸模型的擬合情況良好，回歸方程的代表性較好，能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)實(shí)際情況。由表3 可知整體模型達(dá)到顯著水平(P ＜0.05)，表明該二次方程模型比較顯著，失擬項(xiàng)不顯著(P =0.058 8)，該方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好，可以對(duì)不同條件下的馬錢(qián)子堿和士的寧堿提取量進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.3.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

2.3.3.1 二次回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)，見(jiàn)表3。

表3 方差分析Tab.3 ANOVA

2.3.3.2 提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 采用Design-Expert V.8.0.6 軟件，根據(jù)回歸方程分析結(jié)果，作出綜合效應(yīng)隨因素變化的效應(yīng)面圖，如圖2 ～圖4 所示。結(jié)果預(yù)測(cè)最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，液料比為14 ∶1，提取時(shí)間2 h。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對(duì)綜合效應(yīng)的影響Fig.2 Effects of ethanol content and liquid-to-soild ratio on comprehensive effect

圖3 提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綜合效應(yīng)的影響Fig.3 Effects of extraction time and ethanol content on comprehensive effect

圖4 提取時(shí)間和液料比對(duì)綜合效應(yīng)的影響Fig.4 Effects on extrection time and liquid-tosoild ratio on comprehensive effect

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果綜合效應(yīng)值分別為25.501 2、24.910 5、25.012 8，RSD 為1.2%，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)較好，得到的擬合方程可較好地描述因素與指標(biāo)的關(guān)系。

2.5 Box-Behnken 響應(yīng)面法與正交設(shè)計(jì)優(yōu)化馬錢(qián)子提取工藝的比較 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4 所示。由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得最佳的提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，液料比14 ∶1，回流提取2 h。正交設(shè)計(jì)所優(yōu)選出的馬錢(qián)子提取工藝馬錢(qián)子堿和士的寧的得率分別為17.693 2、24.068 1 mg/g。采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)選出的馬錢(qián)子提取工藝馬錢(qián)子堿和士的寧的得率分別為22.140 8、27.142 0 mg/g。說(shuō)明Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化的馬錢(qián)子提取工藝馬錢(qián)子堿和士的寧的得率更高，工藝更可行。

表4 正交設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Orthogonal design and test result

3 討論

目前用于中藥材的提取溶劑主要有水、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷等［14］。湯淮波等［15］采用不同的提取溶劑提取馬錢(qián)子并測(cè)定士的寧和馬錢(qián)子堿的含有量，發(fā)現(xiàn)水提與醇提和三氯甲烷提士的寧和馬錢(qián)子堿的含有量存在較大差異，醇提與三氯甲烷提士的寧和馬錢(qián)子堿的含有量沒(méi)有顯著差異。馬錢(qián)子為種子類藥物，含有大量的淀粉，油脂，且種子上密被細(xì)密的絨毛。水提取時(shí)提取液混濁，提取液中水溶性雜質(zhì)量多;有機(jī)溶劑提取時(shí)，脂溶性成分含有量較多，生物堿不易分離;酸性乙醇水提取時(shí)，生物堿鹽既能溶于水又能溶于乙醇，士的寧和馬錢(qián)子堿在提取過(guò)程中可能以鹽的形式存在，故提取率較高;且用乙醇水作為提取溶劑，對(duì)環(huán)境污染小，成本較低。本實(shí)驗(yàn)采用了Box-Behnken 響應(yīng)面法進(jìn)行擬合，充分考慮了各因素之間的相互作用，得到了明確的回歸方程，通過(guò)方差分析來(lái)預(yù)測(cè)結(jié)果，提高了實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)性和準(zhǔn)確性，且經(jīng)過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)表明該方法合理穩(wěn)定，用于優(yōu)化馬錢(qián)子提取工藝是可行的。

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