李 琛， 師 哲， 馮 薇， 牛麗穎， 王鑫國*

(1. 河北中醫(yī)學院中藥藥理實驗室，河北 石家莊050091;2. 邢臺市人民醫(yī)院藥劑科，河北 邢臺054000)

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是嚴重威脅中老年人群，尤其是絕經后女性的一種全身性骨代謝疾病，研究表明雌激素缺乏是絕經后婦女骨丟失的重要原因［1］。異黃酮類植物雌激素因其具有與內源性雌激素相似的結構，但少有雌激素樣副作用的發(fā)生，在防治絕經后骨質疏松癥的研究中備受關注。中藥淡豆豉是由豆科植物大豆Glycine max(L.)Merr. 的成熟種子(黑色者)和青蒿、桑葉經發(fā)酵加工而成，主要有效成分為異黃酮類。課題組前期體內實驗采用大鼠去卵巢的方法模擬婦女絕經后骨質疏松，發(fā)現(xiàn)淡豆豉能夠糾正骨質疏松大鼠骨組織形態(tài)計量學參數的異常，改善骨微細結構及骨生物力學性能，提高骨質量［2-3］，但其作用機制尚不明確?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體(estrogen receptor，ER)對調控骨形成和骨吸收的平衡有著重要作用，其表達水平與骨質疏松癥密切相關。本研究以淡豆豉異黃酮為研究對象，觀察淡豆豉異黃酮對大鼠成骨細胞(osteoblasts，OB)增殖及ERβ表達變化的影響，為淡豆豉抗骨質疏松機制的研究提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 出生24 h 以內SD 大鼠，購自河北省實驗動物中心(合格證號1112001)。

1.2 藥物與試劑 淡豆豉異黃酮，由本實驗室自行分離純化，工藝為淡豆豉藥材用石油醚(60 ～90℃)脫脂，將脫脂后的淡豆豉用8 倍量70% 乙醇回流提取3 次，每次2 h，合并提取液回收乙醇，濃縮至每1 mL 含0.225 g 生藥。將0.225 g 生藥/mL 的濃縮液調pH 4.5 作為上樣液，以1.125 g 生藥/mL樹脂的最大上樣量，4 BV/h 的上樣流量通過ADS-7 大孔吸附樹脂，先用5 BV 水洗脫，繼以8 BV 70% 乙醇4 BV/h 洗脫，收集洗脫液，置減壓干燥箱中烘至完全干燥，取出，粉碎成80 目粉末，即得，紫外分光光度法測定總異黃酮含有量為40%。將淡豆豉異黃酮以DMSO 配制100 g/L 的母液，臨用前用無血清DMEM 培養(yǎng)液稀釋至相應工作濃度;大豆異黃酮，本實驗室自制，總異黃酮含有量50%，配制方法同上。17β-雌二醇、ICI 182780(美國Santa Cruz 公司);低糖DMEM (美國Gibco公司);胎牛血清(美國Hyclone 公司);胰蛋白酶、MTT (美國Amresco 公司);膠原酶Ⅱ(美國Invitrogen 公司);RT-PCR 試劑盒(天根生化科技北京有限公司);PCR 引物由上海生物工程有限公司合成，序列為ERβ (317 bp)正向引物5'-TGCCAATCATCGCTCCTCTA-3'，反向引物5'-CGCCGGTTCTTGTCTATGGT-3';GAPDH (450 bp)正向引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，反向引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。ERβ Rabbit mAb (美國Santa Cruz 公司);HRP 標記的山羊抗兔IgG (北京中杉金橋生物技術有限公司);Rabbit Anti-β-Actin (北京博奧森生物技術有限公司);ECL 發(fā)光檢測試劑盒(美國Pierec 公司);其余試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 主要儀器 KHB ST-360 酶標分析儀(上?？迫A生物工程股份有限公司);MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司);Motic AE 倒置顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司);PCR 儀(德國Eppendorf公司);電泳儀、電泳槽(北京六一生物科技有限公司);FR-200A 凝膠掃描系統(tǒng)(上海復日科技有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠成骨細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 參照文獻［4］，采用改良組織塊法分離培養(yǎng)新生SD 大鼠顱骨成骨細胞。用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液(青霉素1 ×105U/L，鏈霉素1 ×105U/L，pH 7.2 ～7.4)進行傳代，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞傳至第5 代，通過細胞形態(tài)學觀察及堿性磷酸酶染色鑒定(使用南京建成cAKP 試劑盒，按說明書步驟操作)，5 ～6 代細胞用于實驗。

2.2 成骨細胞增殖能力測定(MTT) 實驗分為空白對照組，1、10、100、1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮組，淡豆豉異黃酮(1 000 μg/L) + ICI 182780(10 nmol/L)組(ICI 182780 于淡豆豉異黃酮干預前2 h 進行孵育)，1 nmol/L 17β-雌二醇(E2)組，1 000 μg/L 大豆異黃酮(ISO)組。細胞傳至第5代，調整細胞密度為5 ×107個/L，接種至96 孔培養(yǎng)板，藥物干預，分別于48 h 和72 h 吸除培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 無血清DMEM 培養(yǎng)液和20 μL MTT (5 g/L)，繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標儀在492 nm 處檢測OD 值。

2.3 淡豆豉異黃酮對成骨細胞ERβ mRNA 及蛋白表達的影響

2.3.1 RT-PCR 檢測不同質量濃度淡豆豉異黃酮干預后成骨細胞ERβ mRNA 表達 實驗分為空白對照組，1、10、100、1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮不同質量濃度組。細胞接種、藥物干預72 h，Trizol法提取成骨細胞總RNA;將RNA 反轉錄成cDNA，進行PCR 擴增。ERβ 擴增條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min;GAPDH 擴增條件同ERβ。反應產物4 ℃保存。擴增產物進行1% 瓊脂糖凝膠電泳，用Quantity One 圖像分析系統(tǒng)檢測各組ERβ 及GAPDH 電泳帶的光密度值，以兩者之比代表ERβ mRNA 的相對表達量。

2.3.2 Western blot 檢測不同質量濃度淡豆豉異黃酮干預后成骨細胞ERβ 蛋白表達 實驗分組同“2.3.1”項。細胞接種、藥物干預72 h、細胞收集，加入含1% PMSF 的RIPA 裂解液，冰上靜置30 min使細胞充分裂解，收集蛋白。100 ℃煮樣5 min 使蛋白變性，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。根據目的蛋白分子質量配制8% SDS-PAGE 凝膠，調整上樣量一致進行電泳。常規(guī)濕轉操作。室溫下5% 脫脂牛奶封閉2 h。ERβ 抗體按1 ∶400 稀釋，4 ℃孵育過夜，HRP 標記的二抗1 ∶1 000 稀釋，室溫孵育2 h。暗室中加ECL 顯色。曝光、顯影、定影，Quantity One 圖像分析系統(tǒng)檢測各組ERβ 及內參βactin 光密度值，以兩者之比代表ERβ 蛋白的相對表達量。

2.4 ICI 182780、E2及ISO 對成骨細胞ERβ mRNA 及蛋白表達的影響

2.4.1 RT-PCR 檢測ICI 182780、E2及ISO 干預后成骨細胞ERβ mRNA 表達 實驗分為空白對照組，1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮組，淡豆豉異黃酮(1 000 μg/L) + ICI 182780 (10 nmol/L)組(ICI 182780 于淡豆豉異黃酮干預前2 h 進行孵育)，1 nmol/L E2組及1 000 μg/L ISO 組。其余方法同“2.3.1”項。

2.4.2 Western blot 檢測ICI 182780、E2及ISO 干預后成骨細胞ERβ 蛋白表達 實驗分組同“2.4.1”項。方法同“2.3.2”項。

3 結果

3.1 成骨細胞形態(tài)觀察及鑒定 傳代細胞培養(yǎng)3 d后形狀基本穩(wěn)定，呈三角形、纖維束狀、條索狀(圖1 A)。隨著培養(yǎng)時間的延長，可見成骨細胞生長融合，呈“鋪路石”狀。第5 代成骨細胞堿性磷酸酶染色后顯微鏡下可見細胞胞漿內有紫藍色顆粒，呈陽性反應，證明培養(yǎng)的細胞為成骨細胞(圖1 B)。

圖1 大鼠成骨細胞形態(tài)學觀察及堿性磷酸酶染色鑒定(×200)Fig.1 Typical morphology observation of cultured rat osteoblasts and identification by Alkaline phosphatase staining (× 200)

3.2 淡豆豉異黃酮對成骨細胞增殖的影響 與空白對照組相比，淡豆豉異黃酮在質量濃度為1 μg/L時處理48 h 促進成骨細胞增殖(P ＜0.01)，在質量濃度為10、100、1 000 μg/L 時處理48 及72 h均顯著促進成骨細胞增殖(P ＜0.01);1 000 μg/L ISO 干預48 及72 h 促進成骨細胞增殖(P ＜0.01或P ＜0.05);1 nmol/L E2處理48 h 促進成骨細胞增殖(P ＜0.01)。MTT 結果提示，干預48 h 后1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮誘導的成骨細胞增殖作用被10 nmol/L ICI 182780 明顯拮抗(P ＜0.01)，干預72 h 后1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮促增殖作用被ICI 182780 完全拮抗，與空白對照組細胞增殖情況無顯著性差異(P ＞0.05)。且干預72 h 后，1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮作用優(yōu)于同劑量ISO 組(P ＜0.05)(表1)。

表1 不同質量濃度淡豆豉異黃酮、E2 及ISO 對大鼠成骨細胞增殖的影響(±s，n=6)Tab.1 Effects of different concentrations of ISSP，E2 and ISO on the proliferation of rat osteoblasts (±s，n=6)

表1 不同質量濃度淡豆豉異黃酮、E2 及ISO 對大鼠成骨細胞增殖的影響(±s，n=6)Tab.1 Effects of different concentrations of ISSP，E2 and ISO on the proliferation of rat osteoblasts (±s，n=6)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與1 000 μg/L ISSP 比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 OD 值48 h 72 h空白對照組0.203 ±0.012 0.276 ±0.013 1 μg/L 淡豆豉異黃酮 0.263 ±0.014＊＊ 0.295 ±0.015 10 μg/L 淡豆豉異黃酮 0.271 ±0.012＊＊ 0.304 ±0.024＊＊100 μg/L 淡豆豉異黃酮 0.266 ±0.009＊＊ 0.310 ±0.025＊＊1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮 0.273 ±0.009＊＊ 0.320 ±0.017＊＊1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮+ICI 182780 0.235 ±0.024＊＊## 0.289 ±0.010##1 nmol/L E2 0.250 ±0.026＊＊ 0.290 ±0.021 1 000 μg/L ISO 0.253 ±0.030＊＊ 0.298 ±0.017*#

3.3 不同質量濃度淡豆豉異黃酮對成骨細胞ERβ mRNA 及蛋白表達的影響 與空白對照組比較，淡豆豉異黃酮(1、10、100、1 000 μg/L)可以明顯上調ERβ mRNA 的表達水平(P ＜0.01)(圖2 A)。與空白對照組比較，淡豆豉異黃酮(1、10、100、1 000 μg/L)可以明顯上調ERβ 蛋白表達水平(P ＜0.01)(圖2 B)。

圖2 不同質量濃度淡豆豉異黃酮對大鼠成骨細胞ERβ mRNA 及蛋白表達的影響(±s，n=3)Fig.2 Effects of different concentrations of ISSP on the expressions of ERβ mRNA and protein in rat osteoblasts (±s，n=3)

3.4 ICI 182780、E2及ISO 對成骨細胞ERβ mRNA及蛋白表達的影響

3.4.1 ICI 182780、E2及ISO 對成骨細胞ERβ mRNA 表達的影響 與空白對照組相比，1 000 μg/L淡豆豉異黃酮組ERβ mRNA 表達升高(P ＜0.05)，1 nmol/L E2組ERβ mRNA 表達升高(P ＜0.01)。10 nmol/L ICI 182780 能夠完全拮抗1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮上調ERβ mRNA 表達的作用，與空白對照組表達情況無顯著差異(P ＞0.05)(圖3A)。

3.4.2 ICI 182780、E2及ISO 對成骨細胞ERβ 蛋白表達的影響 與空白對照組相比，1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮、1 nmol/L E2及1 000 μg/L ISO 組ERβ蛋白表達水平顯著升高(P ＜0.01 或P ＜0.05)。加入拮抗劑后，1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮的上述作用被完全拮抗，與空白對照組無顯著差異(P ＞0.05)。1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮上調ERβ 蛋白表達的作用優(yōu)于同劑量ISO 組(P ＜0.01)(圖3 B)。

圖3 ICI 182780、E2 及ISO 對大鼠成骨細胞ERβ mRNA 及蛋白表達的影響(±s，n=3)Fig.3 Effects of ICI 182780，E2 and ISO on the expressions of ERβ mRNA and protein in rat osteoblasts (±s，n=3)

4 討論

成骨細胞起源于多能間質干細胞(MSCs)，負責合成骨基質及促進隨后的礦化，是骨形成的主要功能細胞，成骨細胞的增殖在很大程度上決定了最終形成的骨量。本實驗采用原代培養(yǎng)大鼠成骨細胞的方法，觀察淡豆豉異黃酮對成骨細胞增殖的影響，結果顯示:4 種不同質量濃度(1、10、100、1 000 μg/L)的淡豆豉異黃酮均能顯著促進成骨細胞增殖。將雌激素受體拮抗劑ICI 182780 與1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮共孵育，發(fā)現(xiàn)1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮促增殖作用被明顯拮抗，藥物干預72 h 后其促增殖效果降至空白對照組水平，推測淡豆豉異黃酮是通過雌激素受體介導而產生上述影響的。

雌激素受體屬核受體超家族成員，有ERα、ERβ兩種亞型。ERs 表達于所有關系到骨形成及骨吸收的細胞成分中，主要定位于生長板軟骨細胞和成骨細胞中［5］。雌激素通過激活ERα 和ERβ 對成骨細胞發(fā)揮多種生物學效應［6］。研究表明［7-8］多數植物雌激素對ER 具有一定的選擇性，往往對ERβ 的親和力大于ERα。本實驗采用RT-PCR 和Western blot 法檢測淡豆豉異黃酮干預后成骨細胞ERβ mRNA 及蛋白表達水平的變化，發(fā)現(xiàn)不同質量濃度淡豆豉異黃酮均明顯上調ERβ mRNA 及ERβ 蛋白表達(P ＜0.01)。與ICI 182780 共孵育時，成骨細胞ERβ mRNA 及蛋白表達被拮抗，相比單獨應用1 000 μg/L淡豆豉異黃酮作用于成骨細胞ERβ mRNA 及蛋白表達水平下降，實驗結果進一步證實了淡豆豉異黃酮具有雌激素樣作用，其促進成骨細胞增殖的效應可能是通過上調成骨細胞ERβ 表達完成的。

淡豆豉含有大豆中的12 種異黃酮類組分，分為游離型苷元和結合型糖苷兩類。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)淡豆豉炮制后其中的主要異黃酮類活性成分大豆苷元和染料木素含有量升高，相應糖苷含有量降低［9］。也有報道表明游離型苷元是大豆異黃酮在體內發(fā)揮生物活性的主體［10］。本實驗通過體外研究發(fā)現(xiàn)干預72 h 后1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮促成骨細胞增殖及上調ERβ 蛋白表達的作用略優(yōu)于同劑量大豆異黃酮組，這可能與炮制后苷向苷元轉化有關，具體機制有待進一步研究。

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