周先麗， 李映新， 張士軍， 劉 霖， 黃仁彬*

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021;2. 桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣西桂林541004)

六月青為廣西民族特色草藥，系爵床科Acanthaceae 植 物 頂 頭 馬 蘭 (肖 雞 籠)Tarphochlamys affinis (Griff)Bremekhu (Strobilanthes affinis ［Griff］Y. C. Tang)的干燥地上部分［1］。其抗乙肝病毒作用早在《本草拾遺》就有相關(guān)記載，民間常用來治療肝炎、黃疸等疾患［2］。苯乙醇苷類化合物是一類由苯乙醇與糖結(jié)合形成的苷，具有廣泛的生物學(xué)活性，包括保肝、抗炎、抗病毒、抗氧化等［3-5］。由于其分布廣，藥理作用強(qiáng)，受到了研究人員的廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過HepG2.2.15 模型，觀察六月青中一種苯乙醇苷taraffinisoside A 對(duì)HepG2.2.15 細(xì)胞HBsAg 與HBeAg 表達(dá)的影響，以及對(duì)其HBV DNA 合成的抑制作用。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株 HepG2.2.15 細(xì)胞株來自北京302 醫(yī)院，由桂林醫(yī)學(xué)院蘇何玲老師培養(yǎng)傳代贈(zèng)送。

1.2 藥物與試劑 六月青采于廣西靈山，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)黃權(quán)芳副主任藥師鑒定。DMEM 高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibco 公司);MTT (德國Sigma 公司);拉米夫定(3TC，GSK 制藥有限公司，批號(hào)H20030581);乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司);HBsAg 與HBeAg ELISA 試劑盒(上?？迫A生物工程股份有限公司)。

1.3 儀器 熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司);Multiskan Spectrum 全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo 公司);倒置顯微鏡(德國Leica 公司);CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司);生物安全柜(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物的制備與分組 參照文獻(xiàn)［6］，從六月青中提取分離得到化合物taraffinisoside A。用無血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基溶解供試藥物，采用0.22 μm 無菌過濾器過濾后，用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將其稀釋為不同濃度(終濃度2、1、0.5、0.25、0.125 mmol/L)，分組加入96 孔板中，以無血清培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，拉米夫定為陽性對(duì)照。

2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 將HepG2.2.15 細(xì)胞制成2 ×104個(gè)/mL 密度的細(xì)胞懸液，接種于96 孔板，每孔200 μL，置于CO2培養(yǎng)箱，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。24 h 后，換含藥培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)復(fù)孔3 個(gè)，每隔2 天換一次藥，共給藥3 次。第9 天棄上清，換入不含藥培養(yǎng)基80 μL，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO 震蕩10 min 后，使用酶標(biāo)儀在490 nm 波長處測定各孔的吸光值(OD)。細(xì)胞存活率= (實(shí)驗(yàn)組平均OD 值-空白組平均OD 值)/(對(duì)照組平均OD 值- 空白組平均OD 值) ×100%。采用Reed-Muench 法計(jì)算半數(shù)細(xì)胞毒水平(TC50)。

2.3 ELISA 法檢測細(xì)胞上清中的HBsAg 與HBeAg將2 ×104個(gè)/mL 密度HepG2.2.15 細(xì)胞懸液接種于96 孔板，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h 后，換不同濃度含藥培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)復(fù)孔3 個(gè)，每隔2 天換一次含藥培養(yǎng)基，共3 次。分別收集第3、6和9 天的細(xì)胞上清， -20 ℃保存。嚴(yán)格按照試劑盒說明書上方法檢測細(xì)胞上清中HBsAg 和HBeAg水平?？乖种坡?%) = ［(對(duì)照組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組平均OD 值)/對(duì)照組平均OD 值］×100%。采用Reed-Muench 法計(jì)算半數(shù)抑制水平(IC50)。

2.4 FQ-PCR 檢測細(xì)胞上清中的HBV DNA (熒光探針法) HepG2.2.15 細(xì)胞的培養(yǎng)和處理同“2.3”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)部分。嚴(yán)格按照試劑盒說明書上操作，檢測細(xì)胞上清中的HBV DNA。HBV DNA 抑制率= ［(對(duì)照孔拷貝數(shù)-實(shí)驗(yàn)孔拷貝數(shù))/對(duì)照孔拷貝數(shù)］ ×100%。治療指數(shù)(TI) = TC50/IC50，TI ＞2 為有效低毒，1 ＜TI ≤2 為低效低毒，TI ≤1 為有毒性作用［7］。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以(±s)表示，采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P ＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Taraffinisoside A 對(duì)HepG2.2.15 細(xì)胞的毒性作用 MTT 法檢測顯示，藥物各濃度對(duì)HepG2.2.15 細(xì)胞增殖的影響較小，其毒性明顯低于拉米夫定。在實(shí)驗(yàn)濃度下細(xì)胞存活率均大于50%，因此無法通過Reed-Muench 公式計(jì)算TC50，只能估算TC50＞2 mmol/L，結(jié)果見表1。

表1 Taraffinisoside A 對(duì)HepG2.2.15 細(xì)胞的毒性作用(±s，n=3)Tab.1 Cytotoxic effect of taraffinisoside A on HepG 2.2.15 (±s，n=3)

表1 Taraffinisoside A 對(duì)HepG2.2.15 細(xì)胞的毒性作用(±s，n=3)Tab.1 Cytotoxic effect of taraffinisoside A on HepG 2.2.15 (±s，n=3)

注:與空白對(duì)照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 濃度/(mmol·L -1) OD 值 存活率/%空白對(duì)照組 0 0.563 ±0.044—Taraffinisoside A 組 2 0.530 ±0.017 94.14 Taraffinisoside A 組 1 0.528 ±0.027 93.78 Taraffinisoside A 組 0.5 0.551 ±0.019 97.88 Taraffinisoside A 組 0.25 0.565 ±0.038 100.36 Taraffinisoside A 組 0.125 0.567 ±0.035 100.71拉米夫定組 2 0.409 ±0.046＊＊ 72.65拉米夫定組 1 0.457 ±0.031* 81.17拉米夫定組 0.5 0.534 ±0.060 94.85拉米夫定組 0.25 0.566 ±0.024 100.53拉米夫定組0.125 0.604 ±0.025 107.28

3.2 Taraffinisoside A 對(duì)HepG2.2.15 細(xì)胞分泌HBsAg 和HBeAg 的作用 通過ELISA 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，taraffinisoside A 具有良好的體外抑制HBsAg 和HBeAg 分泌的活性。如表2、3 所示，該化合物對(duì)細(xì)胞上清液中HBsAg 和HBeAg 的抑制作用具有明顯的量效關(guān)系，且同時(shí)具有時(shí)效關(guān)系。其對(duì)HBsAg和HBeAg 的抑制率為給藥第 3 天分別為(14.93% ～60.22%)和(5.49% ～42.65%);給藥 第 6 天 分 別 為 (27.32% ～ 78.27%) 和(22.41% ～ 51.06%);給 藥 第 9 天 分 別 為(28.44% ～83.16%)和 (27.31% ～68.27%)。藥物干預(yù)9 d 后，對(duì)細(xì)胞分泌HBsAg 的IC50為0.50 mmol/L，TI ＞4.00;對(duì) HBeAg 的IC50為0.93 mmol/L，TI ＞2.78。3TC 對(duì)細(xì)胞分泌HBsAg 和HBeAg 的IC50分別為0.87 和1.53 mmol/L。

表2 Taraffinisoside A 對(duì)HBsAg 的抑制作用(±s，n=3)Tab.2 Inhibitory effect of taraffinisoside A on HBsAg (±s，n=3)

表2 Taraffinisoside A 對(duì)HBsAg 的抑制作用(±s，n=3)Tab.2 Inhibitory effect of taraffinisoside A on HBsAg (±s，n=3)

注:與空白對(duì)照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 濃度/(mmol·L -1)3 d 6 d 9 d OD 值 抑制率/% OD 值 抑制率/% OD 值 抑制率/%空白對(duì)照組 0 2.612 ±0.092 — 2.255 ±0.052 — 2.078 ±0.070—Taraffinisoside A 組 2 1.039 ±0.045＊＊ 60.22 0.490 ±0.064＊＊ 78.27 0.350 ±0.050＊＊ 83.16 Taraffinisoside A 組 1 1.362 ±0.018＊＊ 47.86 0.638 ±0.039＊＊ 71.71 0.453 ±0.017＊＊ 78.20 Taraffinisoside A 組 0.5 1.850 ±0.017＊＊ 29.17 0.908 ±0.082＊＊ 59.73 0.756 ±0.076＊＊ 63.62 Taraffinisoside A 組 0.25 1.963 ±0.075* 24.85 1.316 ±0.038＊＊ 41.64 1.138 ±0.134＊＊ 45.24 Taraffinisoside A 組 0.125 2.222 ±0.029＊＊ 14.93 1.639 ±0.061＊＊ 27.32 1.487 ±0.029＊＊ 28.44拉米夫定組 2 1.797 ±0.043＊＊ 31.20 0.995 ±0.159＊＊ 55.88 0.614 ±0.055＊＊ 70.45拉米夫定組 1 2.003 ±0.026＊＊ 23.32 1.155 ±0.087＊＊ 48.78 0.838 ±0.027＊＊ 59.67拉米夫定組 0.5 2.234 ±0.024* 14.47 1.300 ±0.035＊＊ 42.35 1.051 ±0.089＊＊ 49.42拉米夫定組 0.25 2.427 ±0.028* 7.08 1.757 ±0.035＊＊ 22.08 1.334 ±0.048＊＊ 35.80拉米夫定組 0.125 2.408 ±0.069 7.81 1.946 ±0.034* 13.70 1.572 ±0.048*24.35

表3 Taraffinisoside A 對(duì)HBeAg 的抑制作用(±s，n=3)Tab.3 Inhibitory effect of taraffinisoside A on HBeAg(±s，n=3)

表3 Taraffinisoside A 對(duì)HBeAg 的抑制作用(±s，n=3)Tab.3 Inhibitory effect of taraffinisoside A on HBeAg(±s，n=3)

注:與空白對(duì)照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 濃度/(mmol·L -1)3 d 6 d 9 d OD 值 抑制率/% OD 值 抑制率/% OD 值 抑制率/%空白對(duì)照組 0 2.931 ±0.035 — 2.695 ±0.045 — 2.395 ±0.064—Taraffinisoside A 組 2 1.681 ±0.134＊＊ 42.65 1.319 ±0.069＊＊ 51.06 0.716 ±0.102＊＊ 68.27 Taraffinisoside A 組 1 2.183 ±0.018＊＊ 25.52 1.561 ±0.117＊＊ 42.08 1.033 ±0.046＊＊ 56.87 Taraffinisoside A 組 0.5 2.445 ±0.044＊＊ 16.58 1.757 ±0.078＊＊ 34.81 1.351 ±0.064＊＊ 43.59 Taraffinisoside A 組 0.25 2.563 ±0.009＊＊ 12.56 1.846 ±0.052＊＊ 31.50 1.551 ±0.031＊＊ 35.24 Taraffinisoside A 組 0.125 2.770 ±0.038* 5.49 2.091 ±0.128* 22.41 1.741 ±0.055＊＊ 27.31拉米夫定組 2 2.166 ±0.034＊＊ 26.10 1.762 ±0.061＊＊ 34.62 1.134 ±0.100＊＊ 52.65拉米夫定組 1 2.450 ±0.034＊＊ 16.41 1.932 ±0.064＊＊ 28.31 1.335 ±0.025＊＊ 44.26拉米夫定組 0.5 2.668 ±0.016* 8.97 2.247 ±0.032＊＊ 16.62 1.567 ±0.019＊＊ 34.57拉米夫定組 0.25 2.837 ±0.063 3.21 2.450 ±0.066＊＊ 9.09 1.755 ±0.081* 26.72拉米夫定組 0.125 2.821 ±0.27 3.75 2.580 ±0.059＊＊ 4.27 1.980 ±0.044＊＊17.33

3.3 Taraffinisoside A 對(duì)HepG2.2.15 細(xì)胞HBV DNA 的抑制作用 從表4 可知，taraffinisoside A 具有良好的體外抑制HBV DNA 表達(dá)的活性，且具有濃度依賴性，隨著給藥濃度的增大，則對(duì)HBV DNA的抑制作用越強(qiáng)，最大濃度抑制率達(dá)到94.23%。而陽性對(duì)照藥物拉米夫定可顯著抑制HBV DNA 的分泌，各濃度組對(duì)細(xì)胞上清HBV DNA 的抑制率均大于99%。

4 討論

乙型肝炎是一種由HBV 引起的嚴(yán)重危害人類身體健康的傳染病，與原發(fā)性肝硬化、肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8-9］。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全世界曾感染HBV 約20 億人，其中病毒攜帶者和患病者大約有4 億人，約占總?cè)藬?shù)的5%［10］。目前在臨床常用的抗HBV 藥物有拉米夫定、干擾素及阿德福韋酯等。這些抗HBV 藥物不但各有嚴(yán)格的臨床適應(yīng)證，而且由于這些藥物治療療程較長、毒副作用大、價(jià)格昂貴等局限性，導(dǎo)致其應(yīng)用受到很大限制。而我國中草藥資源豐富，中草藥成本低廉，不良反應(yīng)小，因此從天然資源和傳統(tǒng)藥物中尋找低毒高效的抗HBV 藥物仍是從事醫(yī)藥研究工作者的迫切任務(wù)［11］。

表4 Taraffinisoside A 對(duì)HBV-DNA 的抑制作用Tab.4 Inhibitory effect of taraffinisoside A on HBV-DNA

本實(shí)驗(yàn)采用HepG2.2.15 細(xì)胞模型對(duì)六月青中一種苯乙醇苷taraffinisoside A 的體外抗乙肝活性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)taraffinisoside A 能夠明顯抑制細(xì)胞上清液中HBsAg 和HBeAg 的分泌，且具有一定的劑量依賴性和時(shí)間依賴性。給藥9 d 后，該化合物對(duì)細(xì)胞分泌HBsAg 和HBeAg 最大抑制率分別達(dá)到83.16% 和68.27%，TI 分別大于4.00 和2.78。拉米夫定對(duì)HBsAg 和HBeAg 最大抑制率分別達(dá)到70.45%和52.65%。結(jié)果說明該化合物有效低毒且比拉米夫定強(qiáng)。此外，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 探針法檢測 taraffinisoside A 作用于HepG2.2.15 細(xì)胞9 d 后上清液中HBV DNA 的含有量。結(jié)果表明，該化合物可顯著降低細(xì)胞上清液中HBV DNA 的含有量，并且對(duì)HBV DNA 的抑制作用隨著給藥濃度的增加而增強(qiáng)，最高濃度抑制率達(dá)到94.23%，陽性對(duì)照拉米夫定各濃度組對(duì)細(xì)胞上清液中HBV DNA 表達(dá)的抑制率均大于99%。結(jié)果顯示該化合物對(duì)HBV DNA 有一定的抑制作用，但比拉米夫定弱。研究表明taraffinisoside A具有明顯的體外抗乙肝作用，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本課題組在前期研究中已證實(shí)六月青具有體內(nèi)外抗乙肝病毒的作用［12］。本次研究在前期研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了六月青有效的體外抗乙肝病毒活性單體成分，為進(jìn)一步開發(fā)六月青抗乙肝活性藥物奠定了理論基礎(chǔ)。

［1］ 陳兆霓，張士軍，唐愛存，等. 六月青皂苷對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的影響［J］. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21(8):1911-1912.

［2］ 張士軍，陳兆霓，林 興，等. 六月青乙醇提取物對(duì)鴨乙型肝炎病毒DNA 的抑制作用［J］. 中成藥，2009，31(3):470-471.

［3］ 鄭曉珂，劉媛媛，馮衛(wèi)生，等. 天然苯乙醇苷類化合物研究進(jìn)展［J］. 中國新藥雜志，2011，20(3):230-234.

［4］ 宋光西，馬玲云，魏 鋒，等. 苯乙醇苷的分布及藥理活性研究進(jìn)展［J］. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7(4):169-171.

［5］ 趙 軍. 四種藥用植物化學(xué)成分及生物活性研究［D］. 杭州:浙江大學(xué)，2009.

［6］ Zhou X L，Wen Q W，Lin X，et al. A new phenylethanoid glycoside with antioxidant and anti-HBV activity from Tarphochlamys affinis［J］. Arch Pharm Res，2014，37(5):600-605.

［7］ 徐叔云. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:1757-1758.

［8］ 冉賢金，胡虞乾. 氧化苦參堿和拉米夫定體外抗乙肝病毒的比較［J］. 中國生化藥物雜志，2012，33(2):142-144.

［9］ 崔美蘭，周海洋，劉 杰，等. 抗乙肝病毒化學(xué)藥物研究進(jìn)展［J］. 國際藥學(xué)研究雜志，2012，39(4):280-285.

［10］ 魚康康，施光峰，李 寧. miRNA 在乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝病中的研究進(jìn)展［J］. 中國病毒病雜志，2014，4(2):150-154.

［11］ 鄭 超，劉 敏，李 健. 田基黃體外抗乙型肝炎病毒活性成分的研究［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014，26(9):1350-1356.

［12］ 丁 華，林 興，黃權(quán)芳，等. 六月青皂苷抗鴨乙型肝炎病毒及保護(hù)肝細(xì)胞的研究［J］. 中國新藥雜志，2011，20(2):167-169.