馬曉毅， 陳勇勇， 閆高穎， 王曉雯， 賈 璞， 王世祥， 劉勤社，， 鄭曉暉*

(1. 西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710069;2. 陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安710068)

活血膠囊是陜西省人民醫(yī)院根據(jù)臨床有效方劑研制而成，由黃芪、桃仁、紅花、牛膝、酸棗仁、川芎、赤芍、枳殼、地黃、桔梗、當(dāng)歸、甘草等十二味中藥組成，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、活血化瘀、理氣安神等功效，對治療氣虛血瘀所致動脈粥樣硬化、心絞痛、頸椎病及腰椎盤突出、過敏性紫癜、神經(jīng)衰弱等有顯著療效［1-4］。研究表明，氣虛血瘀證與免疫反應(yīng)異常和炎癥發(fā)作有密切的關(guān)系［5］。氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本組成單位，與機(jī)體的免疫反應(yīng)有重要相關(guān)性［6］。因此，本實(shí)驗(yàn)以氣虛血瘀大鼠為模型，從血漿中氨基酸濃度變化的角度探討活血膠囊治療氣虛血瘀證的機(jī)制，旨為其臨床應(yīng)用提供可靠的藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 系列高效液相色譜儀(美國Agilent 公司);VER-TEX26 型快速混勻器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);超純水機(jī)(重慶貝研科技發(fā)展有限公司);TGL-16G 高速離心機(jī)(上海浦東光學(xué)儀器廠);KQ 型數(shù)控超聲波清洗器(蘇州江東精密儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SD 大鼠，SPF 級，雄性，體質(zhì)量為200 ～230 g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號為SCXK (陜)-2007-001。

1.3 試劑與藥品 活血膠囊(規(guī)格0.5 g/粒，批號20111207，西安大唐制藥集團(tuán)有限公司)，將活血膠囊內(nèi)容物研磨成細(xì)粉，分別稱取細(xì)粉5、10 和20 g，加入純水研磨至50 mL，制備成10%、20%和40% 的水溶液;天冬氨酸 (Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸 (Gly)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和異亮氨酸(Ile)均購于Sigma 公司;鄰苯二甲醛(批號20110119，天津市光復(fù)精品化工研究所);巰基乙醇(批號20110320，上海五聯(lián)化工廠);四硼酸鈉、氫氧化鈉、無水乙酸鈉和乙酸均購買于天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;乙腈為Fisher 公司生產(chǎn);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱量對照品Asp 3.27 mg、Glu 3.61 mg、Ser 2.58 mg、Gly 1.84 mg、Tyr 4.45 mg、Val 2.88 mg、Phe 4.05 mg、Trp 5.01 mg 和Ile 3.22 mg，用0.1 mol/L HCl 溶液在10 mL 量瓶中定容為2.45 μmol/mL 的混合氨基酸母液，并稀釋成1 250.00、612.50、306.25、61.25、30.63、15.31 和7.66 nmol/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃儲存，備用。

2.2 氨基酸衍生化試劑配制 將13.40 mg 鄰苯二甲醛溶于1 mL 無水乙醇中，加入20 μL 3-巰基乙醇，繼而加入濃度為0.1 mol/L 四硼酸鈉 (pH 9.6)溶液4 mL，搖勻，用0.45 μm 有機(jī)系微孔濾膜過濾，避光低溫密封保存。為維持巰基強(qiáng)度，每天補(bǔ)充20 μL 巰基乙醇，可使用3 d［7］。

2.3 色譜條件 安捷倫TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為醋酸鹽緩沖液 (20 mmol/L，pH 6.5)(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0 ～10 min，18% ～26% B;10 ～30 min，26% ～35%B)，柱溫30 ℃;熒光檢測激發(fā)波長Ex為340 nm;發(fā)射波長Em為455 nm;體積流量0.6 mL/min。

2.4 造模 選擇健康SD 大鼠若干只，采用力竭游泳與饑餓法制作氣虛血瘀模型。每天給予大鼠正常飲食量的1/3，將其放入水［深度(40 ±1)cm、溫度(30 ±2)］℃中游泳，待其出現(xiàn)自然下沉?xí)r撈出，連續(xù)造模一個月。隨后稱取大鼠體質(zhì)量，測定血流變學(xué)(全血黏度、血漿黏度、血細(xì)胞壓積及血細(xì)胞聚集指數(shù))指標(biāo)，以確定造模成功［8-9］。

2.5 分組給藥 選取10 只健康大鼠為正常對照組。選取造模成功的SD 大鼠40 只，隨機(jī)平均分為氣虛血瘀模型組、活血膠囊2、4 和8 g/kg 3 個劑量組，活血膠囊組每天灌胃給藥，正常對照組和模型組灌服生理鹽水，連續(xù)兩周。

2.6 血漿樣品采集與處理 大鼠給藥結(jié)束后，禁食24 h，眼球取血0.3 mL 置于肝素化離心管中，離心10 min (9 000 r/min)，取上清液，凍存于-20 ℃。取血漿0.1 mL，加入4 倍量的乙腈沉淀蛋白，渦旋2 min，10 000 r/min 離心10 min，分離上清液，用0.45 μm 有機(jī)系微孔濾膜過濾。預(yù)處理好的樣品40 μL 加入鄰苯二甲醛衍生液100 μL輕輕混勻，室溫靜置2 min，進(jìn)樣10 μL。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)分析軟件進(jìn)行處理，采用單因素方差(oneway ANOVA )進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量結(jié)果全部采用±s 表示，以P ＜0.05 或P ＜0.01 為其差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性 在上述擬定色譜條件下測定，混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及血漿樣品色譜圖見圖1。由圖可知，經(jīng)過衍生的9 種氨基酸，35 min 內(nèi)得到分離，并且不受血漿中其他內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取空白血漿100 μL 8 份，其中1 份加入20 μL 0.1 mol/L HCl 作為空白對照，其余7 份加入“2.1”項下系列氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，使終濃度為1.28、2.55、5.10、10.21、51.04、102.08 和208.33 nmol/mL。將8 份樣品均按“2.6”項下的方法處理，測定空白血漿加標(biāo)峰面積A1、空白血漿峰面積A2。以氨基酸對照品的峰面積Y =A1 -A2 為縱坐標(biāo)，以氨基酸對照品濃度(nmol/mL)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程(見表1)。結(jié)果表明，各氨基酸對照品在1.28 ～208.33 nmol/mL 之間線性關(guān)系良好。1 ～9 號氨基酸的最低定量限(S/N =10 ∶1)分別為0.43、0.43、0.51、0.61、0.51、0.64、0.85、0.26、1.02 nmol/mL。

圖1 氨基酸色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of amino acids

表1 9 種氨基酸的線性方程(n=6)Tab.1 Linear equations of nine kinds of amino acids(n=6)

3.3 血漿樣品的檢測結(jié)果 取“2.6”項下制備的血漿樣品，在擬定的色譜條件下進(jìn)樣，測定血漿中9 種氨基酸的濃度，結(jié)果如表2 所示。

表2 活血膠囊對氣虛血瘀大鼠血漿中9 種氨基酸的影響(±s，n=10)Tab.2 Effect of Huoxue Capsules on amino acids from plasma in rats with qi deficiency and blood stasis (±s，n=10)

注:與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

對照組/模型組//nmol·mL-1名 稱 (nmol·mL -1)(nmol·mL -1)活血膠囊組( )8 g/kg 4 g/kg 2 g/kg天冬氨酸 6.20 ±0.90＊＊ 3.93 ±0.51 6.13 ±0.81＊＊ 5.13 ±0.75＊＊4.25 ±0.56谷氨酸 31.25 ±4.00＊＊ 21.72 ±1.76 26.38 ±0.83* 26.10 ±0.98* 22.62 ±2.62絲氨酸 49.61 ±6.63＊＊ 100.49 ±5.07 58.50 ±3.17＊＊ 62.77 ±0.49＊＊ 72.76 ±2.32＊＊甘氨酸 79.33 ±3.27＊＊ 46.54 ±3.64 63.92 ±4.58* 50.98 ±4.45 49.12 ±1.54酪氨酸 90.23 ±0.65＊＊ 51.73 ±3.77 89.41 ±2.08* 57.27 ±5.89 50.37 ±7.14纈氨酸 31.33 ±1.02 19.58 ±0.16 21.05 ±3.09 17.06 ±2.37 16.87 ±2.18苯丙氨酸 5.27 ±0.79＊＊ 8.41 ±1.26 5.52 ±0.66＊＊ 5.69 ±0.85＊＊ 7.86 ±1.14色氨酸 21.51 ±2.00＊＊ 10.23 ±1.43 15.09 ±1.91＊＊ 11.40 ±1.39 10.37 ±1.31異亮氨酸 18.91 ±2.42＊＊ 5.42 ±0.75 12.26 ±0.03＊＊9.84 ±0.28 8.77 ±0.21

4 討論

氣虛而無力與邪抗?fàn)?、無力驅(qū)邪外出，從而導(dǎo)致低度炎癥持續(xù)發(fā)生與存在，所以氣虛血瘀的本質(zhì)是一種慢性炎癥，需要通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及抑制炎癥來治療氣虛血瘀證［10-11］。氨基酸作為蛋白質(zhì)的組成物質(zhì)，與機(jī)體淋巴細(xì)胞的數(shù)量、免疫球蛋白的合成等密切相關(guān)［6，12-14］。研究表明，模型組與對照組相比，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸及異亮氨酸濃度降低，絲氨酸、苯丙氨酸濃度顯著升高。從而驗(yàn)證了氣虛血瘀證與血漿中氨基酸濃度的變化有著重要的相關(guān)性。與模型組相比，活血膠囊8 g/kg 可使天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸及異亮氨酸濃度顯著升高，且趨于正常。劑量為4 g/kg 時，天冬氨酸、谷氨酸顯著升高，但2 g/kg 劑量組，氨基酸濃度變化不大。由此可見，活血膠囊能夠通過影響氨基酸的濃度提高機(jī)體免疫功能從而達(dá)到治療氣虛血瘀證的效果。

苯丙氨酸是酪氨酸和色氨酸的代謝產(chǎn)物，模型組與對照組比較，其濃度升高，而酪氨酸和色氨酸的濃度降低，可推測苯丙氨酸的代謝通路可能發(fā)生異常。模型組與對照組相比，絲氨酸濃度顯著升高;活血膠囊組(2 ～8 g/kg)與模型組相比絲氨酸濃度均顯著降低。由此可推測，活血膠囊對調(diào)節(jié)血漿中絲氨酸的濃度有重要的影響，但活血膠囊組對氣虛血瘀證的絲氨酸代謝途徑的影響仍需進(jìn)一步研究。

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