鮑陶陶， 楊曉春， 儲全根

(1. 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥230031;2. 安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥230038)

血管病變是2 型糖尿病最為常見及嚴重的慢性并發(fā)癥之一，是導致糖尿病患者致殘、死亡的主要原因。高糖、炎癥因子、活性氧、高膽固醇、糖基化終產(chǎn)物增多及氧化應(yīng)激等造成血管內(nèi)皮功能障礙是血管病變主要因素［1］，近年來已成為研究熱點并取得一定成就。由于大血管病變是導致糖尿病患者死亡率增加的主要原因［2-3］，占糖尿病死亡原因的65%～75%［4］，為進一步了解2 型糖尿病大血管病變主要情況及中醫(yī)中藥對其作用，本實驗采用透射電子顯微鏡觀察丹蛭降糖膠囊對糖尿病大鼠腹主動脈超微結(jié)構(gòu)及MCP-1、血管內(nèi)皮細胞抵抗素mRNA 表達水平的影響。

1 材料

1.1 動物 6 ～8 周齡SD 雄性大鼠104 只，體質(zhì)量(200±20)g，SCXK (蘇)2011-0003，由常州卡文斯實驗有限公司提供。購入后每籠6 ～7 只喂養(yǎng)，動物自由覓食飲水，在室溫25 ℃、相對濕度(50 ±5)%環(huán)境下喂養(yǎng)1 周，適應(yīng)環(huán)境后開始實驗。

1.2 藥物 丹蛭降糖膠囊(安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，已獲得國家發(fā)明專利，專利號ZL200310112845.1，由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥物制劑中心提供，0.35g/粒);西藥選用鹽酸吡格列酮膠囊，15 mg/粒(杭州中美華東制藥有限公司)。

1.3 試劑與儀器 穩(wěn)豪倍優(yōu)血糖儀購自南京醫(yī)藥合肥大藥房;鏈尿佐菌素STZ (S0130)購自Sigma 公司;電鏡為日本電子公司產(chǎn)品，型號JEM-1230;熒光定量PCR 儀 (PIKOREAL 96)購自Thermo 公司;引物合成購自Invitrogen 公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid TM first Strand cDNA Synthesis Kit)購自Thermo 公司;DL2000 DNA Marker 購自TaKaRa;TRIzol 購自Invitrogen 公司;SYBR Green染料購自Qiagen 公司。

2 方法

2.1 造模分組與給藥 將104 只大鼠隨機分成7組，即正常組，模型組，中藥高、中、低劑量組，西藥組，中西藥結(jié)合組。各組間體質(zhì)量無顯著性差異，明暗周期12/12 h，自由攝食、飲水，正常組繼續(xù)喂以基礎(chǔ)飼料至實驗結(jié)束。模型組及治療組喂以高糖高脂飼料(在68.5%基礎(chǔ)標準飼料中添加10%的豬油、20%的蔗糖、1%的膽固醇、0.5%的膽酸鈉加工制作)，共計4 周。然后按30 mg/kg 體質(zhì)量的劑量腹腔內(nèi)注射STZ，5 d 后檢測血糖指標，不達標者再按25 mg/kg 體質(zhì)量的劑量腹腔內(nèi)注射STZ。造模成功的標準為于最后一次注射5 d 后測定尾靜脈隨機血糖，大于16.7 mmol/L 者為2 型糖尿病(T2DM)造模成功。選擇符合診斷標準的模型大鼠77 只再重新隨機分為6 組，模型組12 只，其余每組13 只，模型組和治療組均繼續(xù)喂以高糖高脂飼料至實驗結(jié)束。給藥方法為中藥高、中、低組大鼠每日分別給予丹蛭降糖膠囊1.08、0.72、0.54 g/(kg·d)灌胃(分別為成人kg 體質(zhì)量折算劑量的12、8、6 倍)。鹽酸吡格列酮膠囊量參照文獻給予10 mg/(kg·d)。模型組與正常組予生理鹽水5 mL/(kg·d)灌胃，中西藥結(jié)合組每日予丹蛭降糖膠囊1.08 g/(kg ·d)混合吡格列酮10 mg/(kg·d)灌胃，給藥時間為8 周。實驗過程中各組大鼠均有2 ～4 只死亡，其中6 只死于毆打，余未明原因死亡，可能與并發(fā)癥相關(guān)(未進行進一步檢測)。末次給藥后大鼠禁食12 h，所有大鼠麻醉處死后剪取腹主動脈進行相關(guān)檢測(出于經(jīng)費、經(jīng)濟效益考慮，隨檢測項目隨機原則抽取適量動物檢測)。

2.2 檢測指標與方法

2.2.1 腹主動脈電鏡觀察 各組隨機取大鼠3 只，麻醉處死后，于大鼠膈膜下及左右髂總動脈的分叉處剪取腹主動脈并切成1 mm3小塊，用體積分數(shù)為2.5%的戊二醛固定12 h，再固定于1% 鋨酸2 h，酒精梯度脫水，環(huán)氧丙烷透明，Epon812 環(huán)氧樹脂包埋，LKB4 型超薄機切片，片厚70 nm。電子染色(用醋酸鈾飽和液和枸櫞酸鉛染液雙染色)，最后置于透射電鏡下觀察切片并拍照。

2.2.2 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng) (RTqPCR) 采用RT-qPCR 方法測定MCP-1、血管內(nèi)皮細胞抵抗素在血管內(nèi)皮中的mRNA 表達。稱取組織50 ～100 mg，加入1 mL TRIzol 勻漿裂解、離心進行RNA 提取，然后加入20 ～50 μL DEPC 水，分別測定OD260 和OD280 值計算純度及濃度，A260/A280值均在1.8 ～2.0 之間。再加入5 × Reaction Buffer 4.0 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、RibolockTM Rnase inhibitor 1 μL、RevertAidTM MMuLV Reverse Transcniptase 1 μL。42 ℃60 min，70 ℃5 min 反轉(zhuǎn)錄，取出上述反應(yīng)液，即為cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。循環(huán)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，共40個循環(huán)。每一次RT-qPCR 反應(yīng)至少重復(fù)3 次。實驗所使用的分析方法為relative quantification study，計算方法為2-ΔΔct。熒光定量引物序列見表1。

表1 熒光定量引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in RT-qPCR

2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)用±s 表示，采用方差分析法，以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義，兩組間顯著性差異采用LSD-t 檢驗。

3 結(jié)果

3.1 腹主動脈超微結(jié)構(gòu)

3.1.1 正常組 內(nèi)膜由內(nèi)皮層、內(nèi)皮下層和內(nèi)彈性膜構(gòu)成。內(nèi)皮下層位于內(nèi)皮之外，為較薄的疏松結(jié)締組織，內(nèi)含少量平滑肌纖維;內(nèi)彈性膜由彈性蛋白構(gòu)成，彈性膜上有許多小孔，各層結(jié)構(gòu)較為完整，內(nèi)皮無增生及脫落，固有膜血管未見明顯充血擴張，少許泡沫細胞形成。內(nèi)膜表面較平滑，內(nèi)皮細胞多扁平，結(jié)構(gòu)清晰，核染色分布均勻，核膜未見擴張，線粒體基本完好，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)基本正常，彈力膜較均質(zhì)，見圖1A、1B。

3.1.2 模型組 內(nèi)膜較正常組明顯增厚且粗糙不平，內(nèi)彈性膜不連貫;線粒體明顯增多、腫脹，線粒體嵴基本消失，呈空泡變性;細胞核與細胞質(zhì)之間出現(xiàn)空隙，核膜消失，內(nèi)皮下細胞浸潤、腫脹和脂質(zhì)沉積，腔內(nèi)大量泡沫細胞及纖維組織，泡沫細胞及增生纖維組織，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，斷裂及減少，彈力膜不均質(zhì)有損傷，見圖1C、1D。

3.1.3 治療組 整體相對模型組病變有所改善，其中，中藥高劑量組接近正常組，其他組療效依次為西藥組、中藥中劑量、中西藥結(jié)合組、中藥低劑量組。

3.1.3.1 西藥組 少數(shù)線粒體腫脹，空泡變，部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，彈力膜較均質(zhì)，見圖1E。

3.1.3.2 中西藥結(jié)合組 部分粒體擴張及空泡變，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有斷裂，部分彈力膜有損傷，見圖1F。

3.1.3.3 丹蛭降糖膠囊高劑量組 少數(shù)線粒體輕微腫脹，空泡化，少數(shù)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，彈力膜較均質(zhì)，見圖1G。

3.1.3.4 丹蛭降糖膠囊中劑量組 部分線粒體破壞有空泡變，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，彈力膜有少數(shù)損傷，見圖1H。

3.1.3.5 丹蛭降糖膠囊低劑量組 線粒體擴張及空泡變，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂，彈力膜損傷，見圖1I。

3.2 各組大鼠MCP-1、血管內(nèi)皮細胞抵抗素的mRNA 表達的情況 經(jīng)藥物治療后，MCP-1、血管內(nèi)皮細胞抵抗素mRNA 表達水平均有下調(diào)，與模型組比較，其差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。其中，中藥高、中劑量組和西藥組間MCP-1、抵抗素無統(tǒng)計學意義，中藥高劑量組與低劑量組、中西藥結(jié)合組MCP-1 差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，表2)。該結(jié)果說明丹蛭降糖膠囊及吡格列酮均能抑制糖尿病大鼠血管MCP-1、抵抗素mRNA 表達水平，其中中藥高劑量組及西藥組效果最好。

表2 各組大鼠腹主動脈MCP-1、抵抗素mRNA 測定結(jié)果比較(±s，n=6)Tab.2 Comparison of result of rat abdominal aortic MCP-1 and resistin mRNA in each group (±s，n=6)

表2 各組大鼠腹主動脈MCP-1、抵抗素mRNA 測定結(jié)果比較(±s，n=6)Tab.2 Comparison of result of rat abdominal aortic MCP-1 and resistin mRNA in each group (±s，n=6)

注:與正常組比較，* P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.01;與模型組比較，▲P ＜0.05;與中藥高劑量組比較，▼P ＜0.05

組別 MCP-1 抵抗素mRNA正常組1.00 ±0.08 1.01 ±0.13模型組 2.50 ±0.21* 2.71 ±0.62*丹蛭降糖膠囊高劑量組 1.45 ±0.06△ 1.70 ±0.13△丹蛭降糖膠囊中劑量組 1.53 ±0.07△ 1.57 ±0.12△丹蛭降糖膠囊低劑量組 2.24 ±0.19▼ 2.42 ±0.46西藥組 1.40 ±0.16△ 1.67 ±0.13△中西藥結(jié)合組 2.02 ±0.20△▼ 2.14 ±0.22▲

圖1 各組大鼠腹主動脈超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Rat abdominal aortic ultrastructures in each group

4 討論

益氣活血法是中醫(yī)治療血管病變的重要治則之一。中藥復(fù)方制劑丹蛭降糖膠囊具有益氣活血功效，由太子參、丹皮、水蛭、澤瀉、生地黃、菟絲子等組成，全方寒溫并調(diào)，補通兼施，共湊益氣活血養(yǎng)陰通絡(luò)之效。以往研究發(fā)現(xiàn)其能改善糖尿病的IR，改善糖代謝，抑制血管內(nèi)皮損傷，保護氧化應(yīng)激損傷組織，干預(yù)糖尿病血管病變的血栓前狀態(tài)［5-7］。選取作為對照的吡格列酮膠囊為臨床所常用的胰島素增敏劑，研究發(fā)現(xiàn)其具有較好降糖作用，可改善胰島素抵抗提高胰島素對細胞的反應(yīng)性，較好改善血管內(nèi)皮功能［8-9］。抵抗素是脂肪細胞和單核能源性細胞因子，不僅參與胰島素抵抗的發(fā)生，而且是重要的血管活性物質(zhì)之一，可直接或間接影響血管內(nèi)皮細胞功能［10-11］。MCP-1 是重要炎癥因子，通過與單核細胞表面受體-2 結(jié)合，使血液中的單核細胞遷入血管內(nèi)膜下，促使血管壁的單核細胞吞噬大量的修飾脂蛋白形成泡沫細胞，促進血管平滑肌細胞的增殖和移動，刺激炎癥產(chǎn)生，與內(nèi)皮細胞功能障礙密切關(guān)系［12-13］。

實驗結(jié)果中，模型組大鼠腹主動脈內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮下脂質(zhì)沉積，有大量泡沫細胞形成，管腔變窄，表明糖尿病血管病變模型成功。經(jīng)藥物治療8 周后，主動脈電鏡顯示益氣活血方和吡格列酮組內(nèi)膜表面突起、增厚，內(nèi)彈性膜不連貫，線粒體增多、腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，斷裂及減少等超微結(jié)構(gòu)均較模型組有所改善，均能減輕糖尿病大鼠腹主動脈形態(tài)學損害，其中中藥高劑量組改善最為明顯，這與前期試驗研究丹蛭降糖膠囊能改善血管內(nèi)皮功能結(jié)果［3-4］相類似。此外益氣活血方和吡格列酮組均能顯著抑制抵抗素及MCP-1 mRNA 水平。本研究電鏡觀察發(fā)現(xiàn)2 型糖尿病模型大鼠主動脈內(nèi)皮細胞的線粒體腫脹、功能障礙，可能與高血糖引起細胞能量代謝障礙，MCP-1，抵抗素有密切關(guān)系［14-17］，電鏡觀察主動脈超微結(jié)構(gòu)變化與MCP-1，抵抗素mRNA 表達情況相對應(yīng)，亦提示MCP-1，抵抗素與T2DM 血管病變有重要關(guān)系，可為治療2型糖尿病血管病變的重要靶點。而研究中中西藥結(jié)合組在主動脈超微結(jié)構(gòu)與抵抗素及MCP-1 mRNA水平不理想，均較單獨中藥組或西藥組稍差，推測原因:①由于實驗過程中的誤差導致錯誤結(jié)果;②排除實驗誤差因素，此結(jié)果可能由于中、西藥劑量比例分配導致，其確切原因有待探索。

綜合實驗結(jié)果表明，運用益氣活血方可能改善和延緩糖尿病血管病變的進展，可為運用中醫(yī)中藥防治2 型糖尿病各類血管并發(fā)癥提供理論依據(jù)及思路，同時也提示可能為其他心腦血管疾病和周圍血管疾病的防治有效途徑。

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