袁宇鵬， 楊玉華， 王蓮萍， 孫 裕

（蘭州佛慈制藥股份有限公司，甘肅蘭州730000）

基于 《中國(guó)藥典》和 《歐洲藥典》的當(dāng)歸藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比研究

袁宇鵬， 楊玉華， 王蓮萍， 孫 裕

（蘭州佛慈制藥股份有限公司，甘肅蘭州730000）

目的優(yōu)選當(dāng)歸歐盟注冊(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。方法對(duì)比 《中國(guó)藥典》2010年版一部和 《歐洲藥典》7.5增補(bǔ)版中當(dāng)歸質(zhì)控的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)不相同的質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果兩部藥典方法均能有效控制當(dāng)歸質(zhì)量，但部分方法有所差異。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為歐洲藥典針對(duì)當(dāng)歸的薄層色譜和阿魏酸定量測(cè)定方法更優(yōu)，而 《中國(guó)藥典》針對(duì)當(dāng)歸的水分測(cè)定方法更優(yōu)。結(jié)論根據(jù)兩部藥典方法的對(duì)比，結(jié)合兩部藥典的長(zhǎng)處，制定我們自己的注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

當(dāng)歸；《中國(guó)藥典》；《歐洲藥典》；標(biāo)準(zhǔn)研究

中藥是中華民族優(yōu)秀的文化瑰寶，但由于中藥產(chǎn)品存在著處方藥味多，成分復(fù)雜、質(zhì)量控制較為困難、缺少系統(tǒng)的藥效、安全性和臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)等問(wèn)題，一直未能按“藥品” 身份進(jìn)入歐洲市場(chǎng)［1-2］。

為了進(jìn)一步規(guī)范歐洲的草藥產(chǎn)品，2004年 《歐盟傳統(tǒng)藥品法》頒布，要求中成藥在歐盟成員國(guó)進(jìn)行傳統(tǒng)藥品注冊(cè)［3-5］。這一舉措有利于開(kāi)辟中成藥的新市場(chǎng)，擴(kuò)大出口，增進(jìn)世界、尤其是歐洲對(duì)中成藥的了解，促進(jìn)中藥的國(guó)際化。中成藥原藥材的質(zhì)量控制是歐盟傳統(tǒng)草藥注冊(cè)所要求的重要內(nèi)容［6-7］。而 《歐洲藥典》和 《中國(guó)藥典》對(duì)中藥材質(zhì)量控制存在一定的差異，所以建立具有中藥特色、歐盟認(rèn)可的質(zhì)量控制模式，是推動(dòng)中藥歐盟注冊(cè)實(shí)質(zhì)性步驟。本實(shí)驗(yàn)以當(dāng)歸藥材為范例，對(duì) 《中國(guó)藥典》和 《歐洲藥典》的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比研究，為濃縮當(dāng)歸丸的歐盟傳統(tǒng)草藥注冊(cè)提供依據(jù)［8-10］。

1 材料與試劑

1.1 儀器 XS205型十萬(wàn)分之一電子天平，AL204型萬(wàn)分之一電子天平 （梅特勒-托利多精密儀器有限公司）；SK250HP超聲波清洗器 （上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；ZF-I型三用紫外分析儀 （上海顧村電光儀器廠）；DGG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；SHIMADZU Prominence高效液相色譜儀（包括低壓二元梯度泵LC-20AB，柱溫箱CTO-20A，二極管陣列檢測(cè)器SPD-M20A，LC Solution工作站）；UPH-I-10T純化水系統(tǒng)（成都超純科技有限公司），HH·S21-Ni型電熱恒溫水浴鍋 （北京華恒萬(wàn)億儀器有限公司）。

1.2 材料 GF254硅膠板 （青島海洋化工廠）；乙醚，乙醇，正己烷，乙酸乙酯，庚烷，冰醋酸，甲苯，甲醇 （分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；乙腈 （色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；磷酸 （色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（UPH-I-10T純化水系統(tǒng)制取）。當(dāng)歸對(duì)照藥材 （120927-201014），藁苯內(nèi)酯對(duì)照品 （111737-201204），歐前胡素對(duì)照品 （110826-201214），蛇床子素對(duì)照品 （110822-200407），阿魏酸對(duì)照品 （110773-201012）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。當(dāng)歸藥材選自蘭州佛慈制藥股份有限公司藥源基地2012年所產(chǎn)當(dāng)歸，經(jīng)甘肅省中醫(yī)學(xué)院中草藥專(zhuān)家及本公司質(zhì)量檢驗(yàn)部技術(shù)人員鑒定為正品當(dāng)歸（Angelica sinensis）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別 《歐洲藥典》和 《中國(guó)藥典》在當(dāng)歸藥材中薄層色譜鑒別存在一定的區(qū)別，薄層板、展開(kāi)劑以及操作步驟存在很大差異，詳細(xì)對(duì)比見(jiàn)表1，圖1，圖2。

表1 《中國(guó)藥典》和《歐洲藥典》中當(dāng)歸藥材薄層色譜鑒別對(duì)比分析

圖1 365 nm下標(biāo)準(zhǔn)圖譜

圖2 254 nm下標(biāo)準(zhǔn)圖譜

2.1.1 按照 《中國(guó)藥典》的薄層色譜鑒別 按照 《中國(guó)藥典》2010年版中當(dāng)歸藥材鑒別進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)歸供試品在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯出明顯的熒光斑點(diǎn)。具體結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 當(dāng)歸藥材與對(duì)照藥材TLC圖譜

2.1.2 按照 《歐洲藥典》的薄層色譜鑒別 按照 《歐洲藥典》7.5增補(bǔ)版進(jìn)行試驗(yàn)。在365 nm下檢測(cè)，供試品當(dāng)歸在藁本內(nèi)酯對(duì)照品對(duì)應(yīng)位置呈現(xiàn)明顯的藍(lán)灰色熒光斑點(diǎn)，蛇床子素對(duì)照品位置熒光斑點(diǎn)顏色較淡。在254 nm下檢測(cè)，供試品當(dāng)歸在藁本內(nèi)酯對(duì)照品對(duì)應(yīng)位置呈現(xiàn)較深顏色的斑點(diǎn)，蛇床子素對(duì)照品位置能看到顏色較淺的斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5。

2.2 水分測(cè)定 《歐洲藥典》和 《中國(guó)藥典》在當(dāng)歸藥材中水分測(cè)定存在一定區(qū)別，詳細(xì)對(duì)比見(jiàn)表2。

圖4 對(duì)照品及當(dāng)歸藥材在365 nm下TLC圖譜

圖5 對(duì)照品及當(dāng)歸藥材在254 nm下TLC圖譜

表2 中國(guó)藥典和歐洲藥典中當(dāng)歸藥材水分測(cè)定對(duì)比分析

2.2.1 試驗(yàn)步驟

2.2.1.1 按照 《中國(guó)藥典》的水分測(cè)定 按照 《中國(guó)藥典》2010版一部附錄ⅨH第二法進(jìn)行測(cè)定。

2.2.1.2 按照 《歐洲藥典》的水分測(cè)定 按照 《歐洲藥典》“2.2.32”項(xiàng)干燥失重檢查法檢測(cè)同批當(dāng)歸水分。

2.2.2 試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)計(jì)算按 《中國(guó)藥典》方法測(cè)得3批當(dāng)歸水分分別為10.4%、9.6%和9.8%；而用 《歐洲藥典》方法測(cè)得結(jié)果分別為10.6%、9.9%和10.3%。這主要是因?yàn)楫?dāng)歸中含有揮發(fā)油，烘干法在烘干水分的同時(shí)也會(huì)損失一部分揮發(fā)油，造成結(jié)果偏高。

2.3 成分測(cè)定 《歐洲藥典》和 《中國(guó)藥典》對(duì)當(dāng)歸藥

表3 當(dāng)歸藥材中阿魏酸的測(cè)定方法對(duì)比分析

2.3.1 對(duì)照品溶液配置

2.3.1.1 對(duì)照品溶液 （A）的配置 精密稱(chēng)定阿魏酸對(duì)照品7.04 mg，至50 mL棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1 mL含140.8μg的溶液；在精確移取上述液體25mL至100 mL棕色量瓶中，加70%甲醇至刻度，制成每1 mL含35.2 μg的溶液，即得。

2.3.1.2 對(duì)照品溶液 （B）的配置 取配置好對(duì)照品溶液（A）約2 mL，放入透明進(jìn)樣瓶中，在波長(zhǎng)為254 nm的紫外燈下照射60 min，即得。

2.3.2 供試品溶液的配置 取當(dāng)歸粉末約0.2 g（過(guò)3號(hào)篩），精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量。用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 按照 《歐洲藥典》的方法對(duì)當(dāng)歸中阿魏酸進(jìn)行測(cè)定

2.3.3.1 系統(tǒng)適用性 實(shí)驗(yàn)室選用Phenomenex Synergi 4u Hydro-RP 80A色譜柱，參數(shù)為150 mm×2.00 mm，填料粒徑4μm。直接使用歐洲藥典方法，對(duì)對(duì)照品溶液 （B）進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)系統(tǒng)適用性，結(jié)果見(jiàn)圖6，相對(duì)應(yīng)峰表見(jiàn)表4。

圖6 對(duì)照品溶液 （B）色譜圖-原比例

表4 圖6中峰信息

由圖6可知，本實(shí)驗(yàn)室HPLC系統(tǒng)若直接使用 《歐洲藥典》方法，阿魏酸保留時(shí)間較標(biāo)準(zhǔn)保留時(shí)間提前約3 min。故對(duì)色譜條件稍作修改，將乙腈-0.085%磷酸溶液的比例由原來(lái)的17∶83改為15∶85，結(jié)果如圖7，相對(duì)應(yīng)峰表見(jiàn)表5。

圖7 改動(dòng)后對(duì)照品溶液 （B）色譜圖

表5 圖7中峰信息

由圖7可知改變流動(dòng)相比例后，本實(shí)驗(yàn)室HPLC系統(tǒng)可以滿足歐洲藥典的系統(tǒng)適用性要求。

2.3.3.2 《歐洲藥典》方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在 《歐洲藥典》色譜條件下分別對(duì)3批當(dāng)歸藥材進(jìn)行檢測(cè)，得3批當(dāng)歸的阿魏酸含有量分別是0.077 5%、0.093 2%和0.095 8%。

2.3.4 《中國(guó)藥典》方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)室選用Phenomenex Luna 5u C18100A色譜柱，參數(shù)為150 mm×4.60 mm，填料粒徑5μm。體積流量選擇為0.8 mL/min。在此色譜條件下分別對(duì)3批當(dāng)歸藥材進(jìn)行檢測(cè)，理論塔板數(shù)均大于5 000，滿足系統(tǒng)適用性要求。結(jié)果得3批當(dāng)歸的阿魏酸含有量分別是0.077 6%、0.093 4%和0.095 7%。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別 經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明兩部藥典方法均能有效地鑒別當(dāng)歸?！吨袊?guó)藥典》方法是以當(dāng)歸藥材為對(duì)照；《歐洲藥典》是以3個(gè)已知的化學(xué)標(biāo)記成分為參照物。通過(guò)對(duì)比分析認(rèn)為 《歐洲藥典》標(biāo)準(zhǔn)更加嚴(yán)格，使用更多的對(duì)照品，并在兩個(gè)波長(zhǎng)下掃描。對(duì)當(dāng)歸藥材的品質(zhì)要求更高，而且給出了較直觀的標(biāo)準(zhǔn)圖譜，方便實(shí)驗(yàn)人員對(duì)薄層鑒別圖譜進(jìn)行判斷。

3.2 水分對(duì)比結(jié)果 按照 《中國(guó)藥典》方法測(cè)得3批當(dāng)歸水分分別為10.4%、9.6%、9.8%，按照 《歐洲藥典》“2.2.32”項(xiàng)干燥失重檢查法測(cè)得當(dāng)歸水分為10.6%，9.9%，10.3%。主要是因?yàn)楫?dāng)歸中含有部分揮發(fā)油成分，以烘干法測(cè)水分時(shí)揮發(fā)油成分也會(huì)減少，從而使測(cè)得的水分偏高，而使用甲苯法可避免這個(gè)問(wèn)題，得到比較準(zhǔn)確的水分?jǐn)?shù)據(jù)。比較實(shí)驗(yàn)方法，使用甲苯法測(cè)水分的 《中國(guó)藥典》更為合理、科學(xué)，但比較指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，《歐洲藥典》對(duì)當(dāng)歸水分的要求較 《中國(guó)藥典》明顯更為嚴(yán)格。

3.3 阿魏酸定量測(cè)定方法對(duì)比分析研究結(jié)果 從兩種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果證明，雖然兩部藥典方法在色譜條件上有些不同，且在色譜峰的保留時(shí)間、峰面積及峰型上都有不同，但兩種方法得到的阿魏酸含有量一致。由此可得出結(jié)論，《中國(guó)藥典》和 《歐洲藥典》的方法均可準(zhǔn)確的測(cè)定當(dāng)歸中阿魏酸的量。個(gè)人認(rèn)為 《歐洲藥典》的方法更優(yōu)，相比于 《中國(guó)藥典》，《歐洲藥典》對(duì)阿魏酸定量測(cè)定方法要求更為具體，明確規(guī)定了使用的色譜柱的柱長(zhǎng)，內(nèi)徑，填料粒徑及體積流量，從而減少了色譜柱差異造成的不一致性。在系統(tǒng)適用性方面，《歐洲藥典》方法規(guī)定了順式阿魏酸和反式阿魏酸的分離度，并且大致規(guī)定了順式阿魏酸和反式阿魏酸的出峰時(shí)間。因?yàn)榉词桨⑽核岜┞对谧贤鉄粝?，就?huì)有一部分反式阿魏酸轉(zhuǎn)化成順式阿魏酸，如果這兩個(gè)峰分離度不足，就會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響；而按照 《歐洲藥典》規(guī)定的出峰時(shí)間，恰好能夠達(dá)到合適的分離度，而又可以盡可能的縮短保留時(shí)間。如此規(guī)定，可以很大程度上減少不同實(shí)驗(yàn)室不同儀器的不一致性。

4 總結(jié)

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)，可以看出雖然兩部藥典在對(duì)當(dāng)歸的一些質(zhì)控指標(biāo)及檢測(cè)方法上有差異，但都能有效地對(duì)當(dāng)歸的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。在具體的方法和評(píng)價(jià)指標(biāo)上，兩部藥典各有長(zhǎng)短。 《中國(guó)藥典》在水分測(cè)定方面使用的甲苯法較《歐洲藥典》的烘干法更精確，且多了浸出物和揮發(fā)油的質(zhì)量控制指標(biāo)；而 《歐洲藥典》對(duì)當(dāng)歸質(zhì)量的要求更高，對(duì)方法的描述也更為具體。結(jié)合兩部藥典的長(zhǎng)處，制定自己的注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)。在兩部藥典描述相同的部分，未作修改繼續(xù)使用；在兩部藥典描述不同的部分，選擇更加合理，更加嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。在薄層色譜方面，兩部藥典的方法均使用，更大程度地對(duì)當(dāng)歸藥材進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別；水分測(cè)定方面，使用了 《中國(guó)藥典》的甲苯法測(cè)水分的方法，但評(píng)價(jià)指標(biāo)使用了更為嚴(yán)格的 《歐洲藥典》的指標(biāo)，這需要我們注冊(cè)的當(dāng)歸藥材有更高的質(zhì)量；阿魏酸定量測(cè)定方面，使用《歐洲藥典》方法，以更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊蟠_保實(shí)驗(yàn)良好的重現(xiàn)性。

［1］Uptake of the traditional use registration scheme and implementation of the provisions of Directive 2004/24/EC in EU Member［R］.EU：European Medicines Agency，2013.

［2］蘇剛強(qiáng)，李伯剛.歐盟草藥藥品注冊(cè)指南［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：20-22.

［3］張中朋.傳統(tǒng)中藥歐盟注冊(cè)路徑探析［J］.中國(guó)現(xiàn)代中藥，2011，13（8）：53-54.

［4］倪昊翔，孫源源.2004/24/EC指令下中藥出口歐盟面臨的注冊(cè)困境及對(duì)策［J］.中國(guó)中藥雜志，2013，38（9）：1447-1449.

［5］張建武，邱 瓊.突破中藥歐盟注冊(cè)障礙的關(guān)鍵因素分析［J］.中國(guó)中藥雜志，2014，39（15）：2972-2977.

［6］Directive 2001/83/EC of the European parliament and of the council of 6 November 2001 on the community code relating to medicinal products for human use［S］.EU：European Parliament and Council，2001.

［7］Directive 2004/24/EC of the European parliament and of the council［S］.EU：European Parliament and Council，2004.

［8］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：124.

［9］European Pharmacopoeia 7.0（Volume 1）［S］.N?rdlingen（Germany）：Druckerei C.H.Beck，2011：51.

［10］European Pharmacopoeia 7.5（supplement）［S］.N?rdlingen（Germany）：Druckerei C.H.Beck，2012：4549-4550.

R921.2

：B

：1001-1528（2015）05-1139-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.050

2014-01-08

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2011BAI05B02）

袁宇鵬 （1988—），男，助理工程師。Tel：13109389193