石召華， 黃文芳， 陳立軍， 劉享平

（1.湖北李時(shí)珍藥物研究院，湖北武漢430061；2.武漢愛民制藥有限公司，湖北鄂州436070；3.湖北省天然組分藥物工程技術(shù)研究中心，湖北鄂州436070）

不同干燥方式對(duì)地龍?zhí)崛∥镏?7種氨基酸的影響

石召華1，2， 黃文芳1，3， 陳立軍1，2， 劉享平2*

（1.湖北李時(shí)珍藥物研究院，湖北武漢430061；2.武漢愛民制藥有限公司，湖北鄂州436070；3.湖北省天然組分藥物工程技術(shù)研究中心，湖北鄂州436070）

目的研究不同干燥方式對(duì)地龍?zhí)崛∥镏?7種氨基酸的影響，確定其適宜的干燥方法。方法采用異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色譜法，測(cè)定并比較真空冷凍干燥、真空減壓干燥和微波干燥3種方式所得地龍干燥樣品以及未經(jīng)干燥樣品中的17種氨基酸的量。結(jié)果冷凍干燥所得產(chǎn)品中氨基酸的損失率小，含水量低，外觀色澤和形態(tài)均較優(yōu)；谷氨酸、組氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸這6種氨基酸在真空減壓干燥下的損失率分別為5.01%、9.41%、7.45%、13.19%、4.99%和6.59%；除門冬氨酸和脯氨酸外，其他15種氨基酸在微波減壓下的損失率均在22.65%～55.97%之間。結(jié)論溫度是地龍氨基酸提取液干燥過程中的重要因素。真空冷凍干燥對(duì)地龍?zhí)崛∥镏械?7種氨基酸的影響較小，是地龍?zhí)崛∥镙^適宜的干燥方式。

地龍；氨基酸；柱前衍生；異硫氰酸苯酯；干燥方式；冷凍干燥

地龍，又稱蚯蚓，是常用中藥之一，其性味咸寒，有清熱熄風(fēng)降壓平喘通絡(luò)利尿之功效［1］。研究發(fā)現(xiàn)地龍氨基酸含有量及組成與其藥理作用有很大關(guān)系［2-3］。廣地龍中含有丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸等多種氨基酸，成分復(fù)雜［4］，采用不同方法對(duì)地龍?zhí)崛∥镞M(jìn)行干燥時(shí)，氨基酸的量可能差異較大。本研究采用異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色譜法，對(duì)地龍?zhí)崛∫哼M(jìn)行真空冷凍干燥、真空減壓干燥和微波干燥3種不同干燥方法所得地龍?zhí)崛∥镏械?7種氨基酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合含水量測(cè)定和產(chǎn)品外觀質(zhì)量等，研究不同干燥工藝對(duì)地龍中氨基酸類化學(xué)成分的影響，優(yōu)選地龍氨基酸提取物的干燥工藝。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 材料 地龍藥材購(gòu)自亳州中藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地廣東，批號(hào)20131106，經(jīng)湖北省藥學(xué)會(huì)中藥鑒定分會(huì)陳科力教授鑒定為鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）的干燥體。

1.2 儀器 RE-5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （上海亞榮生化儀器廠）；LYO-0.5（CIP）真空冷凍干燥機(jī) （上海東富龍科技股份有限公司）；DZG-6020型真空減壓干燥箱 （上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)）；HWZ-5B箱式微波真空干燥機(jī) （廣州興興微波能設(shè)備有限公司）；MA45紅外水分測(cè)定儀 （德國(guó)賽多利斯公司）；安捷倫1260液相色譜儀系統(tǒng) （美國(guó)安捷倫公司）；電子分析天平 （梅特勒-托利多 （上海）儀器有限公司）。

1.3 試劑 三水合醋酸鈉 （分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；冰醋酸 （分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（HPLC級(jí)，美國(guó)TEDIA試劑）；正己烷（HPLC級(jí)，美國(guó)TEDIA試劑）；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水 （杭州娃哈哈集團(tuán)）；17種混合氨基酸對(duì)照品溶液 （門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸）、衍生試劑A（異硫氰酸苯酯-乙腈溶液）和衍生試劑B（三乙胺-乙腈溶液）均來自月旭公司氨基酸分析包。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［5-6］Ultimate Amino Acid AAA氨基酸分析柱 （5μm，4.6 mm×250 mm，月旭材料科技有限公司）；體積流量1.0mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量5μL；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。流動(dòng)相A為0.1 mol/L醋酸鈉溶液（pH 6.5）-乙腈 （93∶7）；流動(dòng)相B為水-乙腈，二元梯度洗脫，洗脫程序見表1?；旌蠈?duì)照品及樣品的HPLC圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 樣品的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取Welch公司17種氨基酸對(duì)照品溶液用水稀釋至原來濃度的1/10倍作為對(duì)照品。Welch公司17種氨基酸對(duì)照品溶液稀釋10倍后，門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸的濃度均為0.25 mol/L，胱氨酸的濃度為0.125mol/L。

2.2.2 地龍藥材提取物的制備 稱取地龍粗粉10 g，加水100 mL，浸泡60 min，超聲處理 （250 W，50 Hz）60 min，12 000 r/min離心10min，取上清液，備用。

2.2.3 地龍氨基酸提取物的不同干燥樣品的制備 以含水量低于5%為干燥標(biāo)準(zhǔn)，精密量取地龍藥材提取物，分別采用不同方式干燥地龍氨基酸組分提取物。

2.2.3.1 真空冷凍干燥工藝 預(yù)凍溫度為-40℃，時(shí)間3 h；升華干燥溫度20℃，升溫時(shí)間2 h，時(shí)間為8 h；解析溫度為40℃，時(shí)間為8 h；工作壓力10～30 Pa。

圖1對(duì)照品與樣品HPLC圖

2.2.3.2 真空減壓干燥工藝 溫度控制在40℃左右，真空度控制在-0.09 MPa，提取液的相對(duì)密度控制在1.25左右，時(shí)間為4 h。

2.2.3.3 微波干燥工藝 將金屬溫度探頭置于樣品表面測(cè)量溫度，調(diào)節(jié)一定的微波功率進(jìn)行輻射 （通過間隙輻射控制溫度在40℃以下）。

2.2.4 衍生步驟 分別將A、B兩種衍生試劑用稀釋劑稀釋至原來濃度的1/5倍，精密量取 “2.2.1”項(xiàng)所制備對(duì)照品溶液1 mL，置于試管中，加入稀釋后的A溶液0.5 mL和稀釋后的B溶液0.5 mL，渦旋混合1 min，在50℃水浴中加熱45min，取出，加入正己烷溶液1 mL，振搖，渦旋混合1 min，靜置30 min，吸取下層澄清液體，用孔徑為0.45μm有機(jī)濾膜濾過，即得。供試品溶液稀釋到適宜濃度后的衍生步驟與對(duì)照品相同。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取Welch公司17種氨基酸對(duì)照品溶液用水稀釋至不同的濃度。分別取其1mL，按照“2.2.4”項(xiàng)下的衍生步驟和 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行操作，再注入液相色譜儀，進(jìn)樣量5μL，記錄各氨基酸峰面積。分別以氨基酸對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)Y，以對(duì)照品進(jìn)樣量 （ng）為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算其回歸方程，見表2。17種氨基酸的相關(guān)系數(shù)在0.999 7～0.999 9之間，表明17種氨基酸的線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取 “2.2.4”項(xiàng)下的衍生化后供試品溶液，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次。17種氨基酸的峰面積RSD值在0.12%～3.4%之間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明儀器精密度良好。

表2 17種氨基酸線性關(guān)系及線性范圍

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取 “2.2.4”項(xiàng)下的制備的同一份衍生化后供試品溶液，在上述色譜色譜條件下，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)行測(cè)定。17種氨基酸的峰面積RSD值在0.17%～2.8%之間。表明供試樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取 “2.2.4”項(xiàng)下的平行制備的5份衍生化后供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。17種氨基酸的峰面積RSD值在0.41%～3.6%之間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含有量的地龍氨基酸提取液5 mL，置于25 mL量瓶中，精密加入稀釋后的氨基酸混合對(duì)照品溶液5 mL，用純凈水稀釋到刻度。按照“2.2.4”項(xiàng)下衍生步驟及 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果，17種氨基酸的的回收率均在94.6%～103.9%之間，RSD在1.2%～4.6%之間，表明此方法回收率良好。

2.4 干燥產(chǎn)品的外觀及含水量測(cè)定 分別采用真空減壓干燥、真空冷凍干燥和微波干燥3種方式對(duì)地龍氨基酸組分提取物進(jìn)行干燥處理。各干燥產(chǎn)品用MA45紅外水分測(cè)定儀測(cè)定其含水量。結(jié)果 （見表3）表明，冷凍干燥所得產(chǎn)品含水量較低，外觀色澤以及形態(tài)較好，且樣品復(fù)溶性好。

表3 地龍?zhí)崛∥锊煌稍锓椒ㄋ卯a(chǎn)品外觀及含水量

2.5 樣品測(cè)定 分別精密量取地龍氨基酸提取液及其不同干燥樣品和混合對(duì)照品溶液，按照 “2.1.4”項(xiàng)下的衍生步驟和 “2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行操作，再注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算地龍氨基酸提取液及其不同干燥樣品種17種氨基酸的含有量 （外標(biāo)一點(diǎn)法），17種氨基酸測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 地龍?zhí)崛∥锊煌稍锂a(chǎn)品中17種氨基酸的測(cè)定結(jié)果 （x±s）

3 討論

測(cè)定氨基酸的方法有柱前衍生化和柱后衍生化。柱后衍生化法是以茚三酮作為衍生化試劑的離子交換色譜法［7］，需專門的氨基酸分析儀。目前常用的柱前衍生化試劑有鄰苯二甲醛（OPA）、6-氨基哇琳基-N-琥珀酰-亞胺基甲酸酯（AQC）、2，4-二硝基氟苯 （DNFB）以及異硫氰酸苯酯（PITC）等。OPA不能和仲氨基酸反應(yīng)［5-6］；AQC的衍生化水解產(chǎn)物會(huì)影響分離度［7-8］；DNFB試劑具有強(qiáng)致癌性，且需要在避光和一定的溫度條件下才能進(jìn)行此反應(yīng)，反應(yīng)條件苛刻［9］；PITC衍生物單一、穩(wěn)定，衍生副產(chǎn)物對(duì)HPLC測(cè)定無(wú)干擾，衍生化反應(yīng)速度快，一、二級(jí)氨基酸均可被測(cè)定，目前應(yīng)用較廣泛［10-12］，所以本實(shí)驗(yàn)采用異硫氰酸苯酯作為柱前衍生化試劑來測(cè)定地龍?zhí)崛∫褐械?7種氨基酸。

本研究采用真空減壓干燥、真空冷凍干燥和微波干燥三種常用干燥方法對(duì)地龍?zhí)崛∥镞M(jìn)行干燥處理，根據(jù)所得干燥產(chǎn)品中17種氨基酸的含有量以及含水量和外觀情況，優(yōu)選地龍氨基酸提取物合適的干燥方式。結(jié)果表明冷凍干燥所得產(chǎn)品種氨基酸的損失率小，含水量低，外觀色澤和形態(tài)均較優(yōu)。17種氨基酸中，對(duì)溫度較不敏感的氨基酸有門冬氨酸和脯氨酸，3種干燥方式對(duì)這兩種氨基酸含有量均沒有顯著性影響。而谷氨酸、組氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸對(duì)溫度比較敏感，45℃減壓干燥下這6種氨基酸的含有量損失率分別為5.01%、9.41%、7.45%、13.19%、4.99%、6.59%。而在微波干燥下，除門冬氨酸和脯氨酸這兩種比較穩(wěn)定的氨基酸外，其他15種氨基酸的含有量損失率均在22.65%～55.97%之間。綜上，氨基酸類成分對(duì)熱較敏感，溫度是地龍氨基酸提取物干燥過程中的重要因素。真空冷凍干燥是地龍氨基酸提取物較適宜的干燥方式。

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：1001-1528（2015）05-1135-04

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2014-07-18

國(guó)家十二五重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目 （2014ZX09201-022-03）；湖北省重大科技創(chuàng)新專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（2013ACC005）

石召華 （1975—），男，博士，高級(jí)工程師，從事中藥制劑研究。Tel：（0711）3818216，E-mail：whimyf@163.com

*通信作者：劉享平 （1964—），男，博士，高級(jí)工程師，從事中藥現(xiàn)代化研究。Tel：（0711）3818208，E-mail：lxp821@sina.com