鄧少東， 林 勵， 張 鵬

（1.廣東醫(yī)學院，廣東東莞523808；2.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東廣州510006）

多指標綜合評分法優(yōu)選巴戟天低聚糖提取工藝

鄧少東1， 林 勵2*， 張 鵬2

（1.廣東醫(yī)學院，廣東東莞523808；2.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東廣州510006）

目的優(yōu)選巴戟天低聚糖提取工藝。方法在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗法，以液固比、乙醇體積分數、提取時間、提取次數為考察因素，以出膏率及低聚糖、巴戟甲素和耐斯糖提取率為指標，進行綜合評分。結果優(yōu)選出的最佳提取工藝為加入15倍量的40%乙醇浸泡24 h，提取2次，每次1.0 h。結論優(yōu)化的提取工藝結果可靠，評價指標可控，對巴戟天的質量控制與開發(fā)利用具有一定意義。

巴戟天；低聚糖；多指標；正交試驗；提取

巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的肉質根，歸腎、肝經，具有補腎助陽之功效，自古被譽為 “補腎陽之要藥”，已證實巴戟天糖類物質的量近50%，其中以低聚糖類成分為主［1］。近期藥效研究表明，巴戟天低聚糖可顯著提高擬癡呆大鼠的學習記憶能力［2］、改善癡呆癥狀［3］，其中巴戟甲素、耐斯糖等低聚糖單體活性成分也顯示具有神經細胞保護作用［4］、抗抑郁［5］、抗骨質疏松［6］等多種生物活性，表明巴戟天低聚糖類成分具有顯著的開發(fā)利用前景。然而，目前巴戟天糖類成分提取工藝研究主要采用UV法檢測，以總多糖或總低聚糖含有量為指標進行研究［7-8］，其選擇指標單一、不夠系統(tǒng)全面。本課題組在前期研究［9］中已建立巴戟天中多種低聚糖類成分量的測定方法，發(fā)現巴戟甲素、耐斯糖在藥材中的量較高，其中耐斯糖為 《中國藥典》2010年版規(guī)定的質控指標，而巴戟甲素具有顯著的生物活性［10-13］。為此，本實驗以巴戟天低聚糖提取物的出膏率、低聚糖提取率以及其主要的活性成分巴戟甲素、耐斯糖提取率為考察指標，采用正交試驗法優(yōu)選巴戟天低聚糖的提取工藝，以期為巴戟天藥材的質量控制、生產加工及其低聚糖類成分的開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

美國Waters 2695型液相系統(tǒng)（配備Waters 2424型蒸發(fā)光散射檢測器）；BP211D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；Genpure超純水系統(tǒng)（德國TKA公司）；XB ridge TMAmide親水性色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5μm，美國Waters公司）；Cary50型紫外可見分光光度計（美國Varian公司）；KQ-500型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；Freezone 2.5 L冷凍干燥機（美國Labconco公司）；RV5型真空泵（英國Edwards公司）；佳美SK-1快速混勻器 （江蘇金壇市佳美儀器廠）；HHS6數顯恒溫水浴鍋 （常州普天儀器公司）。

巴戟甲素 （按專利201010224513.2方法自制，純度98.8%）；耐斯糖（日本WAKO公司，純度99%，批號292-64121）；果糖（美國Amresco公司，純度99%，批號57-48-7）；乙腈 （色譜純，美國Merk公司）；三乙胺、鹽酸、乙醇等試劑均為國產分析純，實驗用水均為自制超純水；巴戟天藥材于2012年1月購自廣東德慶巴戟天GAP基地，經廣州中醫(yī)藥大學中藥學院實驗中心林勵研究員鑒定，其原植物為茜草科巴戟天屬巴戟天Morinda officinalis How。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備 取巴戟天粉末50 g（過3號篩），精密稱定，按實驗要求，以不同體積分數的乙醇作為提取溶劑浸泡過24 h后，于不同料液比中90℃水浴回流提取不同時間、次數。濾過，取濾液濃縮至稠浸膏后，冷凍干燥，計算得出膏率（出膏率=干膏質量÷藥材總質量）。精密稱取干膏0.1 g，移至10 mL量瓶中，加40%乙醇至刻度，搖勻，過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2 定量測定 取上述供試品溶液，分別按照本課題組前期建立的UV法測定低聚糖的量、親水作用色譜-蒸發(fā)光散射檢測法［9，14］測定巴戟甲素及耐斯糖的量。

2.3 單因素考察試驗 以料液比 （1∶3，1∶5，1∶10，1∶15，1∶20）、乙醇體積分數 （30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）為主要考察因素，分別考察各因素對出膏率及低聚糖、巴戟甲素和耐斯糖提取率 （提取率=各指標測得含有量×出膏率）的影響，結果見表1～3。

表1 料液比對提取效果的影響Tab.1 Effects of liquid-solid ratio on extraction

表2 乙醇體積分數對提取效果的影響Tab.2 Effects of ethanol concentration on extraction

表3 提取時間對提取效果的影響Tab.3 Effects of time on extraction

由表1可知，隨著料液比的增大，出膏率也逐漸增大，當料液比為1∶20時出膏率最大，高達73.56%；當料液比為1∶15時，低聚糖、巴戟甲素及耐斯糖提取率均趨近最大值，其提取率分別為52.88%、4.21%、4.25%。因此，本實驗正交試驗設計中選擇料液比為1∶10、1∶15、1∶20 3個水平進行考察。

由表2可知，隨著乙醇體積分數的增大，各指標得率均逐漸下降。根據前期研究［8］，當提取溶劑中乙醇體積分數低于40%時，會提取出部分多糖影響測定結果。因此，本實驗正交試驗設計中選擇乙醇體積分數為40%、50%、60%3個水平進行考察。

由表3可知，隨著提取時間的延長，各指標得率均逐漸上升。推測有部分多糖水解或溶出，影響檢測，同時為了節(jié)省的原因，故本實驗正交試驗設計中選擇提取時間為0.5、1.0、1.5 h 3個水平進行考察。

2.4 正交試驗設計 采用L9（34）正交表進行實驗設計 （見表4），結合單因素試驗結果，進一步考察料液比 （A）、乙醇體積分數 （B）、提取時間（C）、提取次數 （D）對出膏率、低聚糖、巴戟甲素及耐斯糖提取率的影響，并采用綜合評價中的TOPSIS法［15-16］對正交試驗數據進行綜合分析，以確定最佳提取工藝。試驗結果見表4，方差分析見表5。

表4 L9（34）正交試驗結果Tab.4 Result of orthogonal test and analysis

表5 綜合評分方差分析Tab.5 ANOVA analysis

采用TOPSIS法計算出各指標的客觀權重系數分別為：低聚糖提取率 （35.6%） ＞巴戟甲素提取率 （23.8%）＞耐斯糖提取率 （21.3%） ＞出膏率 （19.3%）。

正交試驗結果顯示：因素A的K值為K2＞K3＞K1，說明料液比1∶15的提取較好；因素B的K值為K1＞K3＞K2，說明40%乙醇提取較好；因素C的K值為K2＞K1＞K3，說明提取時間為1.0 h提取較好；因素D的K值為K2＞K3＞K1，說明提取次數為2次時提取較好。

由直觀分析表明，因素B的極差R值最大，因此是主要影響因素。其次是因素C、A、D，故各因素對出膏率、低聚糖、巴戟甲素及耐斯糖提取率的影響程度依次為溶劑中乙醇體積分數＞提取時間＞液固比＞提取次數。

由方差分析結果可得出，各因素對實驗結果均無顯著性影響。因此，根據正交實驗結果優(yōu)選出的最佳工藝條件為A2B1C2D2，即用15倍量的40%乙醇，提取2次，每次1 h。

2.5 提取工藝驗證 分別精密稱取同一批巴戟天藥材粉末 （過3號篩），平行3份，各50 g，用15倍量的40%乙醇浸泡24 h后，于90℃水浴回流提取1.0 h，濾過，取濾渣再次提取1.0 h，合并濾液，濃縮至稠浸膏后，冷凍干燥。在此工藝下，出膏率、低聚糖、巴戟甲素及耐斯糖的提取率分別為（81.79±1.06）%、（65.31±2.21）%、（6.37± 0.15）%、（7.39±0.17）%，說明采用的最佳工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

本實驗前期曾取同一批巴戟天藥材連續(xù)提取3次，發(fā)現第3次的提取液中所含成分已較少，從節(jié)約成本出發(fā)本研究的正交試驗設計選擇提取1～3次。曾采用純水提取，由于巴戟天中還含有多糖等水溶性成分，對實驗結果干擾夠大，且影響巴戟甲素、耐斯糖的定量測定，因此本研究采用30%以上的乙醇溶液對藥材進行提取，可避免干擾。

多指標優(yōu)選中藥提取工藝是提高中藥制劑質量的重要手段，符合中藥中多組分、多靶點的作用特點，能更合理的評價整個工藝過程。目前，中藥提取工藝綜合評價中常用的經驗性權數法，主要是由專家或研發(fā)者根據評價指標的重要性來確定權重系數，主觀因素影響較大。而本實驗采用多指標綜合評價中的TOPSIS法，計算出各指標的客觀權重系數，同時對各指標的正交試驗數據進行綜合評分并綜合分析，結合生產上提取成本等因素，最終確定最佳提取工藝，驗證實驗結果表明，優(yōu)選的工藝各指標性成分的提取率較高，工藝合理、可行。

［1］陳地靈，帥 歐，林 勵，等.炮制方法對巴戟天糖類成分的影響研究［J］.中國藥房，2012，23（3）：217-223.

［2］陳地靈，張 鵬，林 勵，等.巴戟天低聚糖對Aβ25-35致擬癡呆模型大鼠學習記憶障礙的影響［J］.中國藥理學通報，2013，29（2）：271-275.

［3］陳地靈，張 鵬，林 勵，等.巴戟天低聚糖對Aβ25-35致擬癡呆模型大鼠的保護作用［J］.中國中藥雜志，2013，38（9）：1306-1309.

［4］Chen D L，Zhang P，Lin L，et al.Protective effect of bajijiasu againstβ-amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells［J］.Cell Mol Neurobiol，2013，33（6）：837-850.

［5］崔承彬，楊 明，姚志偉，等.中藥巴戟天中抗抑郁活性成分的研究［J］.中國中藥雜志，1995，20（1）：36-38.

［6］李 楠，王和鳴，郭素華，等.巴戟天多糖及其水提取物對體外培養(yǎng)成骨細胞活性的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（23）：4570-4573.

［7］馬建春，何 偉.正交試驗優(yōu)選巴戟天低聚糖提取工藝［J］.中國藥房，2012，19（47）：4453-4457.

［8］程力惠，王建壯，盧麗霞.正交設計優(yōu)選巴戟天中多糖提取工藝［J］.中藥材，2010，29（1）：125-129.

［9］鄧少東，肖鳳霞，林 勵，等.親水作用色譜-蒸發(fā)光散射檢測器聯用法同時測定巴戟天中5種低聚糖的含量［J］.中國中藥雜志，2012，32（22）：3446-3449.

［10］陳潔文，王 勇，譚寶璇，等.巴戟素補腎健腦作用的神經活動基礎［J］.廣州中醫(yī)藥大學學報，1999，16（4）：314-317.

［11］譚寶璇，陳朝鳳，陳潔文，等.巴戟素補腎抗衰老的作用機制研究［J］.新中醫(yī)，2000，32（11）：36-38.

［12］陳朝鳳，譚寶璇，陳潔文，等.巴戟素對急性缺血性腦損傷保護作用的機制研究［J］.廣州中醫(yī)藥大學學報，2000，17（3）：215-217.

［13］譚寶璇，蘇文，陳潔文，等.巴戟素對衰老大鼠空間學習記憶力改善作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2000，11（2）：95-97.

［14］林芳花，林 勵，劉曉涵，等.紫外分光光度法測定巴戟天中的低聚糖含量［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（1）：213-216.

［15］方積乾.衛(wèi)生統(tǒng)計學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011.

［16］閔祥云.應用EXCEL進行TOPSIS綜合評價［J］.疾病控制雜志，2003，7（3）：252-255.

Extraction optiMization of oligosaccharides froMMorindae Officinalis Radix by multi-index orthogonal experiment

DENG Shao-dong1， LIN Li2*， ZHANG Peng2
（1.Guangdong Medical College，Dongguan 523808，China；2.College of ChineseMateria Medica，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

Morindae officinalis Radix；oligosaccharide；multi-index；orthogonal experiment；extraction process

R284.2

：A

：1001-1528（2015）05-0978-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.011

2014-06-15

國家自然科學基金項目 （81403085）；東莞市醫(yī)療衛(wèi)生科技計劃一般項目 （2014105101295）；廣東醫(yī)學院科研基金博士學位人員科研啟動項目 （B2013007）

鄧少東（1986—），男，博士，從事中藥資源開發(fā)利用與新藥研究。E-mail：donggdyxy@163.com

*通信作者：林 勵 （1954—），男，研究員，博士生導師，從事中藥資源開發(fā)利用與新藥研究。Tel：（020）39358270，E-mail：LL76611@126.com