馬 琨， 胡國(guó)強(qiáng)

(1. 河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院，河南省骨科醫(yī)院，河南 洛陽(yáng)471002;2. 河南大學(xué)藥學(xué)院，河南 開(kāi)封475004)

骨肉瘤是最常見(jiàn)好發(fā)于青少年的非造血源性原 發(fā)性惡性骨腫瘤。雖然新輔助化療開(kāi)展以來(lái)，病人的術(shù)后5 年生存率有所提高，但其化療耐藥非常普遍，且許多化療藥物還存在嚴(yán)重的副作用。近年來(lái)，尋找安全有效的中藥抗腫瘤藥物已成為研究熱點(diǎn)。莪術(shù)醇(curcumenol)是莪術(shù)提取物的有效成分［1］，具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤等作用。已有研究證實(shí)莪術(shù)醇抗腫瘤的機(jī)制主要是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。已有文獻(xiàn)報(bào)道，莪術(shù)醇能夠誘導(dǎo)肺癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞凋亡［2-3］。細(xì)胞凋亡的形式有經(jīng)典途徑凋亡和自噬性途徑凋亡。有關(guān)莪術(shù)醇誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞自噬性凋亡的研究，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以骨肉瘤MG-63 細(xì)胞為對(duì)象，觀察了莪術(shù)醇對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬的作用，為探討莪術(shù)醇抗骨肉瘤治療提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、藥物與主要試劑 人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所;莪術(shù)醇標(biāo)準(zhǔn)品(100185-200506)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，實(shí)驗(yàn)前用DMSO 助溶配制母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM 稀釋到所需濃度。DMEM 培養(yǎng)基(Gibco，with high glucose)、胎牛血清，杭州四季青生物公司生產(chǎn);Lipofectamine 2000 購(gòu)自Invitrogen 公司;3-甲基腺嘌呤(3-MA)購(gòu)自Sigma 公司，批號(hào)M9281;二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)、Hochest33258 和PI 購(gòu)自Promega 公司。FITC-annexinⅤ/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Bender公司;鼠抗雞囊(C4)β-actin 單抗、ECL western blot 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Santa Cruz 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人骨肉瘤MG-63 細(xì)胞培養(yǎng)于10%滅活胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，置于環(huán)境為37 ℃，5%二氧化碳(CO2)飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.3 MTT 實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63 細(xì)胞培養(yǎng)在于5% CO237 ℃恒溫條件下，用胰酶和EDTA 消化，以每孔1 ×107個(gè)的細(xì)胞接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

(1)實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組依次加入不同質(zhì)量濃度莪術(shù)醇各10 μL，藥物終質(zhì)量濃度分別為15、30、60、120 mg /L;每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。分別在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 μL MTT (5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后棄去上清液，加入DMSO 150 μL/孔，在96 孔酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm 處的吸光度值(A 值)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)和半數(shù)抑制濃度(IC50)，半數(shù)抑制濃度(IC50)效方程式［fa/fu= (D/Dm)m］計(jì)算得出。

(2)應(yīng)用IC50值的莪術(shù)醇分別處理MG-63 細(xì)胞0、24、48、72 h，并設(shè)空白對(duì)照組，細(xì)胞增殖抑制率時(shí)間依賴(lài)性用上述方法計(jì)算得出。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞分為4 組，分別為對(duì)照組、莪術(shù)醇組、3-MA 組、莪術(shù)醇+3-MA 組。對(duì)照組僅加入細(xì)胞培養(yǎng)液;莪術(shù)醇組給予終質(zhì)量濃度63.5 mg/L 的莪術(shù)醇(根據(jù)MTT 實(shí)驗(yàn)得出的IC50值);3-MA 組加入濃度為2 mmoL/L 的3-MA:莪術(shù)醇+3-MA 組，3-MA 于莪術(shù)醇(終質(zhì)量濃度為63.5 mg/L)處理前1 h 加入。

1.5 FITC-annexinⅤ/PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞到離心管，每組細(xì)胞數(shù)為1 ×106個(gè)/mL，經(jīng)離心、洗滌，室溫避光培養(yǎng)15 min，PBS 緩沖液沖洗。加入適量AnnexinⅤ-FITC/PI 溶液5 μL 4 ℃下孵育20 min，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.6 Hoechst 33258/PI 活細(xì)胞聯(lián)染進(jìn)行細(xì)胞凋亡形態(tài)變化的判定 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)的MG-63細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板，各種處理按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行，PBS 洗3 次，用特異結(jié)合DNA 的熒光染料Hoechst 33258 (10 mg/L)和PI (10 μg/mL)進(jìn)行細(xì)胞聯(lián)染。37 ℃避光染色15 min，紫外光激發(fā)，OLYMPUS-BX51 熒光顯微鏡觀察CCD 拍片?；罴?xì)胞呈淺藍(lán)色，凋亡及壞死的細(xì)胞呈紅色，核固縮，凝集狀。隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，每張爬片計(jì)數(shù)細(xì)胞大于等于1 000 個(gè)，以死亡細(xì)胞數(shù)與計(jì)數(shù)的總細(xì)胞數(shù)比值的百分?jǐn)?shù)表示細(xì)胞死亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 細(xì)胞自噬免疫熒光檢測(cè) 各組細(xì)胞以1 ×104個(gè)/mL 密度接種于6 孔板，板內(nèi)放置蓋玻片，按照Lipofectamine 2 000 (Invitrogen)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將綠色熒光蛋白(EGFP)-LC3b 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，24 h 后加藥處理，再孵育24 h，經(jīng)PBS 洗滌，直接在Olympus-BX51 熒光顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，LC3 細(xì)胞以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)兩個(gè)以上亮染點(diǎn)為陽(yáng)性，用陽(yáng)性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比計(jì)量細(xì)胞自噬率。

1.8 Western-blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 各種處理于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行，作用24 h 后用細(xì)胞裂解液RIPA 200 μL 充分提取蛋白，樣品蛋白濃度用考馬斯亮藍(lán)G-250 法檢測(cè)，均衡每組蛋白濃度后，以12% SDSPAGE 凝膠電泳分離。5%脫脂奶粉過(guò)夜封閉，加入一抗(1 ∶200)過(guò)夜孵育于4 ℃封閉袋中，1 ∶4 000二抗孵育(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體)1 h。結(jié)果用化學(xué)發(fā)光法顯示，壓片曝光。

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)醇對(duì)骨肉瘤MG-63 細(xì)胞的增殖抑制作用呈質(zhì)量濃度依賴(lài)性 如圖1 所示用不同質(zhì)量濃度的莪術(shù)醇(15、30、60、120 mg/L)處理MG-63 細(xì)胞48 h，結(jié)果顯示莪術(shù)醇以劑量依賴(lài)性方式抑制MG-63 細(xì)胞增殖，平均48 h IC50為63.5 mg/L。加入自噬抑制劑3-MA 后，莪術(shù)醇的抑制作用仍然隨著藥物質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，但是普遍比相應(yīng)單純莪術(shù)醇處理組低(P ＜0.05)。圖2 顯示用質(zhì)量濃度為63.5 mg/L 的莪術(shù)醇分別作用于MG-63 細(xì)胞0、24、48、72 h，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，莪術(shù)醇抑制細(xì)胞增殖作用增強(qiáng)(P ＜0.05)。

圖1 莪術(shù)醇抑制MG-63 細(xì)胞增殖的質(zhì)量濃度變化圖(±s，n=3)Fig.1 Inhibitory effect of curcumenol to the proliferation of MG63 cells (±s，n=3)

2.2 莪術(shù)醇對(duì)MG-63 細(xì)胞凋亡率的影響 圖3 顯示，63.5 mg/L 莪術(shù)醇作用48 h，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析早期和晚期細(xì)胞凋亡率之和，空白對(duì)照組為(1.53 ±0.21)%，莪術(shù)醇組為(44.97 ±2.39)%，與對(duì)照組相比，莪術(shù)醇組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P ＜0.05);單純3-MA 組細(xì)胞凋亡率為(2.54 ±0.45)%，與空白對(duì)照組相比，無(wú)明顯差別;莪術(shù)醇+3-MA 組細(xì)胞凋亡率為(19.13 ±2.32)%，與莪術(shù)醇組相比明顯下降(P ＜0.05)。

2.3 莪術(shù)醇對(duì)MG-63 細(xì)胞凋亡核形態(tài)變化的影響

圖2 莪術(shù)醇抑制MG-63 細(xì)胞增殖的時(shí)間變化圖(±s，n=3)Fig.2 Inhibitory effect of curcumenol to the proliferation of MG63 cells (±s，n=3)

圖3 莪術(shù)醇對(duì)MG-63 細(xì)胞凋亡率的影響(±s，n=3)Fig.3 Apoptotic rates of MG-63 cells treated with curcumenol (±s，n=3)

Hochest33258 和PI 活細(xì)胞熒光雙染，由于PI 不能通過(guò)正常的細(xì)胞膜，Hoechst 則為膜通透性的熒光染料。因此此項(xiàng)技術(shù)可以較好的區(qū)分死亡和存活細(xì)胞。細(xì)胞處于凋亡晚期或壞死早期時(shí)核顯紅色，活細(xì)胞核內(nèi)顯藍(lán)色。如圖4 所示莪術(shù)醇處理MG-63 細(xì)胞48 h后，細(xì)胞死亡形式主要為凋亡，表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集，細(xì)胞核呈圓珠狀，形成凋亡小體?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞凋亡率為(0.97 ±0.31)%，莪術(shù)醇組為(36.52±7.33)%;與對(duì)照組相比，莪術(shù)醇組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P ＜0.05);單純3-MA 組細(xì)胞凋亡率為(1.14±0.62)%，與空白對(duì)照組相比，無(wú)明顯差別;莪術(shù)醇+3-MA 組細(xì)胞凋亡率為(16.25 ±8.87)%，與莪術(shù)醇組相比明顯下降(P ＜0.05)。

圖4 莪術(shù)醇誘導(dǎo)MG-63 細(xì)胞核凋亡形態(tài)的變化，(±s，n=3)Fig.4 Cellular morphological changes in MG-63 cells treated with curcumenol (±s，n=3)

2.4 莪術(shù)醇對(duì)MG-63 細(xì)胞自噬變化的影響 由圖5 可見(jiàn)，轉(zhuǎn)入綠色熒光蛋白(EGFP)-LC3b 質(zhì)粒后，空白對(duì)照組MG63 僅在個(gè)別細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)到微小點(diǎn)狀凝集熒光，無(wú)明顯熒光顆粒形成;自噬率約為(2.11 ±0.15)%;莪術(shù)醇組可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)凝集熒光增強(qiáng)，有顆粒狀熒光凝集斑形成，自噬率為(23.12 ±5.21)%;與空白對(duì)照組相比，莪術(shù)醇組細(xì)胞自噬率明顯增加(P ＜0.05);單純3-MA 組細(xì)胞自噬率為(1.89 ±0.58)%，與空白對(duì)照組相比，無(wú)明顯差別;莪術(shù)醇+3-MA 組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)熒光顆粒較小，且數(shù)量不及莪術(shù)醇組，細(xì)胞自噬率為(11.68 ± 5.29)%，與莪術(shù)醇組相比明顯下降(P ＜0.05)。

圖5 莪術(shù)醇誘導(dǎo)MG-63 細(xì)胞自噬的變化，(±s，n=3)Fig.5 Images of curcumenol induced autophagy of MG-63 cells (±s，n=3)

2.5 莪術(shù)醇對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3 (LC3)是酵母Atg 的同源體，是自噬體膜上的標(biāo)志。LC3 包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種存在形式。自噬增強(qiáng)時(shí)，LC3-Ⅰ表達(dá)水平下降，而LC3-Ⅱ上升。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Beclin 1 是酵母的同源體，可調(diào)控自噬體的生成，故其表達(dá)水平可作為自噬程度的重要指標(biāo)。如圖6 所示，莪術(shù)醇作用后，與對(duì)照組相比，LC3-Ⅰ表達(dá)下降，LC3-Ⅱ表達(dá)升高(P ＜0.05)。自噬相關(guān)蛋白Beclinl 表達(dá)也增多。單純3-MA 組與空白對(duì)照組相比，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，而經(jīng)過(guò)自噬抑制劑3-MA 預(yù)處理后，LC3-Ⅱ和Beclinl 表達(dá)，與單純莪術(shù)組相比明顯減少(P ＜0.05)。

圖6 莪術(shù)醇對(duì)MG-63 細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-l、Beclin l 蛋白表達(dá)的影響(±s，n=3)Fig.6 Effect of curcumenol on the LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰand Beclin1 expression of MG-63 cells (±s，n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)MTT 結(jié)果顯示，莪術(shù)醇對(duì)MG-63 細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈劑量-時(shí)間依賴(lài)性。提示莪術(shù)醇對(duì)MG-63 細(xì)胞有殺傷作用。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，莪術(shù)醇組細(xì)胞凋亡率增高，而加入自噬抑制劑3-MA 后，細(xì)胞凋亡率下降。Hochest33258 和PI 活細(xì)胞熒光雙染結(jié)果也顯示，莪術(shù)醇處理后的細(xì)胞死亡形式為凋亡，結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)一致。由此推測(cè)，莪術(shù)醇引起細(xì)胞凋亡的形式主要是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

自噬是通過(guò)自噬體與溶酶體的融合，介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)成分降解［4］，是一種選擇性的非Caspases 依賴(lài)的程序性細(xì)胞死亡。它通過(guò)降解細(xì)胞中多余或受損的大分子或細(xì)胞器，循環(huán)利用降解產(chǎn)物，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，但是嚴(yán)重的自噬可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。自噬過(guò)程可以分為3 個(gè)階段:①在低氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏等因素刺激下，自噬體膜脫落形成杯狀雙層膜，包繞被降解物;②分隔膜逐漸延伸，完全將要被降解的胞漿成分包繞，形成自噬體［5］;③自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體并降解其內(nèi)成分，循環(huán)再利用。LC3 是酵母ATG8 基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同源物，能靶向定位于自噬體膜，參與自噬的形成。LC3 分為L(zhǎng)C3-Ⅰ和Ⅱ型［6］，I 型常規(guī)表達(dá)，游離存在于胞質(zhì)。發(fā)生自噬時(shí)，I 型LC3 被加工與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，形成LC3-Ⅱ。Ⅱ型LC3 蛋白結(jié)合并始終位于胞內(nèi)的實(shí)體膜上，其含量與自噬泡數(shù)量呈正比［7］。

為驗(yàn)證莪術(shù)醇在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)有自噬參與，本實(shí)驗(yàn)又檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)合蛋白LC3 熒光顆粒。本實(shí)驗(yàn)將EGFP-LC3b 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MG-63 細(xì)胞，未經(jīng)處理的對(duì)照組或單純3-MA 組細(xì)胞很少有自噬發(fā)生。莪術(shù)醇誘發(fā)的細(xì)胞自噬體較多，細(xì)胞自噬率也高;用3-MA 處理后，細(xì)胞自噬被抑制，結(jié)合該組細(xì)胞凋亡率較單純莪術(shù)組有所下降的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推斷，莪術(shù)醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡包含有部分自噬性凋亡。

Beclin 1 是酵母ATG6/Vps30 基因在哺乳動(dòng)物中的同源物［8］，位于人類(lèi)染色體17q21 上，大約有150 kb，其表達(dá)與自噬的發(fā)生正相關(guān)。Zeng 等的［9］研究顯示，高劑量的鋁可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡通過(guò)過(guò)度激活Beclin1 依賴(lài)的自噬信號(hào)。Qian 等［10］的研究表明白血病細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡的同時(shí)，伴有Beclin1 的表達(dá)上調(diào)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證莪術(shù)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否包含有部分自噬性凋亡。本實(shí)驗(yàn)又用Western blot 方法檢測(cè)了自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化的比值和自噬標(biāo)志性蛋白Beclin-1 的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，莪術(shù)醇組細(xì)胞LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化的比值及Beclin-1 蛋白表達(dá)明顯比對(duì)照組高，應(yīng)用自噬抑制劑3-MA 后，可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。上述結(jié)果表明，莪術(shù)醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡形式確實(shí)包含有自噬性凋亡。

綜上所述，莪術(shù)醇抑制MG-63 細(xì)胞增殖的機(jī)制主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡的形式還包含自噬性凋亡。莪術(shù)醇誘導(dǎo)MG-63 細(xì)胞自噬性凋亡的靶點(diǎn)和具體的信號(hào)分子途徑還有待進(jìn)一步研究。

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