張慧曄， 潘雪峰，2， 徐小飛， 鄧喬華， 王德勤*

(1. 廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東廣州510515;2. 廣東藥學院中藥學院，廣東廣州510006)

復方穿心蓮片為OTC 藥，清熱解毒，利濕;常用于風熱感冒、咽喉疼痛，濕熱泄瀉;處方由穿心蓮、路邊青二味藥材組成。復方穿心蓮片收載于《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第十九冊［1］，原標準鑒別項下(1)和(2)分別是為了檢驗制劑中是否含有穿心蓮和路邊青，選用的對照化合物或對照藥材分別是脫水穿心蓮內(nèi)酯和路邊青對照藥材。針對路邊青的鑒別項，操作時候對無水條件的要求嚴格，得到的結果中黃色斑點不清晰，不利于觀察和鑒別;另外，在《中國藥典》2010 年版、2015 年版的編寫中，均主張薄層鑒別中不再使用例如“苯”、“三氯甲烷”這樣的有毒試劑。因此，本研究對提取方法、展開系統(tǒng)及顯色方法進行了新的探索，擯棄了存在于原薄層鑒別方法中不利于操作者安全的試劑“三氯甲烷”，得到了一個安全、便利和專屬性強的薄層鑒別方法。

1 儀器與試藥

穿心蓮內(nèi)酯(批號110797-200307)、脫水穿心蓮內(nèi)酯(批號110854-201007)、路邊青對照藥材 (批號121227-200804)，穿心蓮對照藥材(批號121082-201004)購于中國食品藥品檢定研究院，新穿心蓮內(nèi)酯(批號120106)，購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。硅膠G (批號051007)青島海洋化工廠生產(chǎn)，自制板規(guī)格10 mm ×20 mm，厚度0.5 mm;預制板為青島海洋化工廠生產(chǎn)，規(guī)格為10 mm ×20 mm，厚度0.2 ～0.25 mm。其他所用試劑為分析純。

復方穿心蓮片5 批，F(xiàn)2D001、F2D002、F2D003 為廣州白云山和記黃埔中藥有限公司生產(chǎn);L11I111、L11K232為廣東羅浮山國藥股份有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備 取復方穿心蓮片15 片，除去糖衣，研細，加石油醚30 mL，超聲30 min，棄去石油醚液，殘渣加入乙酸乙酯30 mL，超聲30 min，乙酸乙酯部分濃縮至1 mL，作為供試品溶液。

2.2 對照品及對照藥材溶液的制備 取路邊青藥材10 g，加200 mL 水，超聲30 min，濾過，用等體積乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分濃縮至2 mL，作為路邊青對照品溶液。取穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。

2.3 陰性對照藥材溶液的制備 穿心蓮600 g，照復方穿心蓮片的制法，制成不含路邊青藥材的陰性對照品;路邊青1 400 g，照復方穿心蓮片的制法，制成不含穿心蓮藥材的陰性對照品;再照供試品溶液的制備方法，分別制備成不含穿心蓮的陰性供試品溶液和不含路邊青的陰性供試品溶液。

2.4 薄層層析 參照《中國藥典》2010 年版一部附錄VIB 薄層色譜法，吸取供試品溶液、對照品與對照藥材溶液及陰性溶液各8 μL，分別點樣于同一普通硅膠G 薄層板上。以展開劑乙酸乙酯-甲醇(95 ∶5)上行展開，取出，晾干，噴以1% ～2.5%香草醛的60% ～70%硫酸溶液。供試品色譜中，在與穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品色譜相應的位置上，顯相同的斑點;再用電熱吹風機或電熱板加熱至斑點顯色清晰，自然光下觀察，在與路邊青對照藥材色譜相應的位置上，顯一個相同斑點，其中的藍青斑點為路邊青主要專屬性斑點。環(huán)境溫度為室溫，濕度為70%。見圖1。

圖1 復方穿心蓮片薄層鑒別圖譜

3 討論

薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)是一種常用的微量分離方法，20 世紀50 年代開始得到廣泛使用，可用于樣品分離和分析［2］。傳統(tǒng)TLC 技術由于精密度和重現(xiàn)性均較差，曾被其他快速發(fā)展起來的分離分析技術所取代，80 年代后，隨著薄層在色譜板、點樣技術、展開技術方面的發(fā)展，薄層色譜的規(guī)范化和儀器化程度大大提高。加之直觀、經(jīng)濟、簡便的特點，仍然在中藥多樣品的分析中發(fā)揮作用［3］。

常規(guī)薄層色譜的固定相為未改性的硅膠、氧化鋁、硅藻土、纖維素和聚酰胺等，其中最常用的為硅膠正相色譜，其優(yōu)點是設備簡單，易于操作，成本小;高效薄層色譜(HPTLC)采用更細、更均勻的改性硅膠和纖維素為固定相，對吸附劑進行疏水和親水改性，可以實現(xiàn)正相和反相薄層色譜分離，提高了色譜的選擇性［4］，如棒狀薄層色譜(TLC-FID)、加壓薄層色譜 (OPLC)、離心薄層色譜(CTLC)、膠束薄層色譜 (M-TLC)［5］、包合薄層色譜(ICC)［6］、二維薄層(2D TLC)［7］等。薄層色譜檢測方法根據(jù)吸收原理有吸收測定法、熒光測定法和熒光猝滅法，如薄層掃描法［8］;另外薄層色譜法還能與紅外光譜［9］、質譜［10］、拉曼光譜［11］等檢測方法聯(lián)用，與生物信息學結合發(fā)展為全息薄層色譜鑒別［12］和薄層指紋圖譜鑒別［13］，與生理生化結合，出現(xiàn)了薄層生物自顯影技術［14］。本實驗使用常規(guī)的薄層色譜進行鑒別復方穿心蓮片。經(jīng)多批樣品試驗，該方法主斑點清晰，易于檢出，重現(xiàn)性好，可以準確、有效地鑒別出路邊青和穿心蓮。

3.1 與《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第十九冊復方穿心蓮片薄層色譜方法相比，修訂后的方法增加了薄層鑒別的專屬性?，F(xiàn)有方法中［1，15-16］，針對路邊青的顯色斑點為黃色，此點常常為黃色條帶，較模糊，經(jīng)過改變顯色試劑的濃度與顯色方式，發(fā)現(xiàn)噴以1% ～2.5%香草醛的60%～70%硫酸溶液后加熱，能較好地對路邊青藥材中一藍青色特異斑點進行顯色，可見光下觀察，斑點清晰，重現(xiàn)性好且不易受潮濕環(huán)境影響;另外，本實驗改變了原有方法中的顯色步驟，可同時鑒別穿心蓮和路邊青兩種藥材，在噴了顯色劑后，針對穿心蓮使用了在不加熱的方法，使得穿心蓮顯色的斑點雜質較少，更能凸顯出穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯主斑點的特征性。針對路邊青使用了加熱方法，使得路邊青的鑒別更加有特征性。

3.2 本方法直接用石油醚、乙酸乙酯等有機試劑對藥材進行超聲萃取，比現(xiàn)有技術方法［1，15-16］更加安全、簡便。在對路邊青分部萃取中發(fā)現(xiàn)，藍青色特異斑點存在于乙酸乙酯部分和正丁醇部分，在石油醚部分不存在，在正丁醇萃取后余下的部分少量存在，可能是正丁醇萃取不完全的原因造成的。穿心蓮內(nèi)酯，新穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯也同樣在穿心蓮乙酸乙酯和正丁醇萃取部分中存在。另外，對薄層條件進行摸索中，試驗了石油醚-乙酸乙酯-甲醇系統(tǒng)，石油醚-丙酮-甲醇系統(tǒng)，得到的效果均不如乙酸乙酯-甲醇系統(tǒng)的效果好。

3.3 對影響薄層鑒別的主要因素如不同薄層板的比較、展開溫度、濕度等進行考察，發(fā)現(xiàn)薄層板的種類、溫度對分離效果影響都較小;本方法更適合南方濕度較大的環(huán)境，在高濕度條件下，原鑒別中針對路邊青的黃色斑點很容易暈染，本實驗中所述的藍青色斑點則很清晰;對于濕度較低的環(huán)境，本實驗中所述的藍青色斑點比較難以顯色，在展開劑中滴加0.2% ～0.4%的水用于展開即可。

［1］ 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會. 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑［S］. 第十九冊，1996:115.

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