唐安玲， 宋 英 ， 李圓圓， 王聰穎， 賀寶瑩

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都610075;2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都610072)

續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asper Wall. ex Henry 的干燥根，其味苦、性微溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補肝腎、強筋骨、續(xù)折傷、止崩漏、安胎等功效，臨床上主要用于腰背酸痛，肢節(jié)瘓痹，損筋折骨，胎動漏紅，血崩下血，以及遺精、帶下、癰疽瘡腫［1］。續(xù)斷的有效成分有皂苷、生物堿、揮發(fā)油、多糖及其他生物活性成分［2］，川續(xù)斷皂苷Ⅵ為續(xù)斷藥材及其制劑中的主要有效成分。中藥煮散是指將中藥飲片粉碎成顆粒與水共同煎煮后，去渣取汁而制成，它保持了傳統(tǒng)湯劑的煎煮過程和療效，能夠很好的適應(yīng)病情需要、隨證加減，具有傳統(tǒng)湯劑吸收快、療效高的優(yōu)點［3-4］。續(xù)斷煮散顆粒是續(xù)斷傳統(tǒng)飲片經(jīng)粉碎、加水?dāng)D出制粒、干燥等工序制成的單味中藥煮散顆粒劑，是根據(jù)中藥煮散機理而研制的新型中藥飲片，其目的是保留其藥性藥效的同時，減少續(xù)斷的用量和煎煮時間，提高續(xù)斷的利用率［5-6］。本實驗以干膏率和川續(xù)斷皂苷Ⅵ量［7-8］為評價指標(biāo)，通過正交試驗和溶出曲線考察續(xù)斷煮散顆粒的煎煮工藝，對續(xù)斷煮散顆粒進行煎煮質(zhì)量評價。

1 儀器與試藥

HP-1100 高效液相色譜儀(美國惠普公司):惠普四元梯度泵，惠普自動進樣器，惠普柱溫箱;Hypersil BDS 色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司);BP211D 電子分析天平(德國Sartorius 公司);XFB-400B 小型中藥粉碎機(吉首市中誠制藥機械廠);電熱恒溫水浴鍋(雙列八孔，北京市永光明醫(yī)療儀器廠);超聲清洗器(AS10200，天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

續(xù)斷飲片(四川新荷花中藥飲片股份有限公司，產(chǎn)地四川，批號1107292)，續(xù)斷煮散顆粒(實驗室自制)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品(批號110724-200513，中國藥品生物制品檢定所，純度為93.5%)。乙腈為色譜純;水為超純水(實驗室自制);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交設(shè)計考察樣品處理的煎煮條件

2.1.1 因素水平的確定 根據(jù)中藥傳統(tǒng)的煎煮方法和預(yù)試驗結(jié)果，確定煎煮次數(shù)為2 次。選擇加水量、浸泡時間、煎煮時間為主要的3 個考察因素，并制定每個因素下面的3 個水平。按L9(34)進行正交試驗，以篩選出續(xù)斷煮散顆粒的最佳煎煮工藝，因素水平設(shè)計見表1。

表1 續(xù)斷煮散顆粒煎煮工藝的因素與水平

2.1.2 川續(xù)斷皂苷Ⅵ的測定

2.1.2.1 色譜條件 Hypersil BDS C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×150 mm);流動相為乙腈-水(30:70);體積流量1.0 mL/min;柱溫25 ℃;進樣量20 μL;檢測波長為212 nm;理論塔板數(shù)按川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰計算應(yīng)不低于3 000。

2.1.2.2 溶液制備 對照品溶液制備:精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品3.75 mg，置25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。供試品溶液制備:精密稱取續(xù)斷煮散顆粒5 g，按正交表方案進行試驗，煎煮2 次，濾過，濃縮定容至200 mL。精密吸取正交藥液2 mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試溶液。陰性供試品溶液制備:吸取缺續(xù)斷藥液2 mL，同法制備陰性供試品溶液。

2.1.2.3 線性關(guān)系考察 分別取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液1、3、5、7、15 μL 進樣，分別按“2.1.2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，以川續(xù)斷皂苷Ⅵ色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進樣量(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=2 156.04X -8.896 26 (r =0.999 96)。計算得出，在0.037 29 ～2.610 3 μg 范圍內(nèi)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ的進樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.2.4 精密度試驗 取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液20 μL連續(xù)進樣6 次，結(jié)果得到川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品峰面積均值為606.1，RSD 為0.7%，表明儀器精密度良好。

2.1.2.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液，按照“2.1.2.1”項下相應(yīng)色譜條件，分別于制樣后0、2、4、6、8、10 h 進樣20 μL，記錄峰面積，計算，結(jié)果樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積均值為510.8，RSD 為0.6%，表明供試品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.2.6 重復(fù)性試驗 對同一批樣品溶液，按照“2.1”項下相應(yīng)方法分別制備供試品溶液6 份，精密吸取各供試品溶液20 μL，按上述相應(yīng)色譜條件測定，記錄峰面積，計算得到川續(xù)斷皂苷Ⅵ均值為1.437 mg/mL，RSD 為1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.2.7 加樣回收率試驗 精密量取已得含有量的樣品制備溶液1 mL (川續(xù)斷皂苷Ⅵ為1.437 mg/mL)于25 mL 的棕色量瓶中，共6 份，分別精密加入川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液(0.518 mg/mL)3 mL，按照“2.1”項下相應(yīng)方法制備供試品溶液，按“2.1.2.1”項下相應(yīng)色譜條件測定，通過計算，得出川續(xù)斷皂苷Ⅵ的加樣回收率平均值為99.3%，回收率在95% ～105%之間，RSD 為2.8%，表明該方法的準(zhǔn)確度較好。

2.1.2.8 樣品測定 分別精密吸取“2.1.2.2”項下制備的川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液、續(xù)斷煮散顆粒和傳統(tǒng)飲片的供試品溶液各20 μL 進樣，按“2.1.2.1”項下色譜條件測定。對照品及樣品的色譜圖如圖1 所示。

圖1 對照品及樣品溶液色譜圖

2.1.3 干膏收率的測定 精密吸取“2.1”項下各供試品溶液20 mL，分別置已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，試驗結(jié)果見表2。

2.2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果 根據(jù)續(xù)斷煮散顆粒性質(zhì)和臨床療效，選擇川續(xù)斷皂苷Ⅵ量和干膏收率為評價指標(biāo)，進行綜合加權(quán)評分。綜合評分結(jié)果見表2。

從直觀分析得出，綜合得分與加水量關(guān)系密切，為最主要因素，其次是煎煮時間、浸泡時間;從方差分析結(jié)果得出(表3)，因素A (加水量)P ＜0.05，具有顯著性，B(浸泡時間)、C (煎煮時間)不顯著。為降低成本，節(jié)約能源，優(yōu)選煎煮工藝為A3B2C3，即加20 倍量水，浸泡10 min，煎煮20 min。

2.3 驗證試驗 為考察所選因素水平中最佳工藝的穩(wěn)定性及可行性，按照最佳工藝條件進行3 次驗證試驗，取同一批號續(xù)斷煮散顆粒25 g，共3 份，加20 倍量水，浸泡10 min，煎煮2 次，每次20 min，藥液定容至1 000 mL，按上述制備方法制備供試品溶液，并同法測定川續(xù)斷皂苷Ⅵ量和干膏收率，結(jié)果見表4。

表2 煎煮工藝條件正交試驗結(jié)果

表3 方差分析

表4 煎煮工藝驗證試驗結(jié)果

結(jié)果:川續(xù)斷皂苷Ⅵ含有量均值為58.36 mg/g，RSD=2.25%，表明該工藝穩(wěn)定可行，故確定優(yōu)選的工藝為A3B2C3。

2.4 川續(xù)斷皂苷Ⅵ溶出曲線比較 分別取8 份同一批號的續(xù)斷傳統(tǒng)飲片，每份精密稱定5 g，用10 倍量水浸泡30 min 后，隨機取4 份進行煎煮，分別在煮沸后5、10、20、30 min 時進行濾過，濾液定容至200 mL，作為樣品溶液。剩下的4 份樣品根據(jù)同樣的方法分別在煮沸后30 min 時進行濾過，收集濾液備用，再向每份濾渣中加入10 倍量水，分別在煮沸后5、10、20、30 min 時進行濾過，合并兩次濾液，再定容至200 mL，作為樣品溶液。精密吸取上述溶液各2 mL 于25 mL 棕色量瓶中，用甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后的續(xù)濾液作為供試品溶液。用同樣方法制備續(xù)斷煮散顆粒的供試品溶液。精密吸取各樣品溶液25 mL，分別置已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量。以川續(xù)斷皂苷Ⅵ煎出量和干膏收率為評價指標(biāo)，采用綜合加權(quán)評分法，在不同煎煮時間點，對續(xù)斷煮散顆粒及其傳統(tǒng)飲片的煎出效率進行評分，繪制煎出曲線。見圖2。

圖2 續(xù)斷煮散顆粒與傳統(tǒng)飲片溶出曲線

將測定結(jié)果輸入軟件SPSS 13.0 進行統(tǒng)計分析，經(jīng)配對t 檢驗處理后，得到P =0.000。即不同時間點續(xù)斷煮散顆粒煎液中指標(biāo)成分的溶出量都要高于續(xù)斷傳統(tǒng)飲片煎液，且差異具有極顯著性(P ＜0.01)。

3 討論

在優(yōu)化續(xù)斷煮散顆粒的煎煮工藝時采用正交試驗法，確定方法為加20 倍量水，浸泡10 min，煎煮20 min。由于川續(xù)斷皂苷Ⅵ是續(xù)斷煮散顆粒的主要有效成分，其溶出量的高低對續(xù)斷經(jīng)配伍后的臨床療效影響較大，因此，選擇川續(xù)斷皂苷Ⅵ作為評價指標(biāo)之一，權(quán)重系數(shù)相應(yīng)較高，以0.6 為宜。干膏收率作為煎煮工藝的參考指標(biāo)，能部分反映出續(xù)斷煮散顆粒的干膏收率，但干膏收率與療效不成正比例關(guān)系，故綜合評價時權(quán)重系數(shù)相應(yīng)較小，以0.4 為宜。

本研究在預(yù)試驗時，對不同顆粒粒度(最粗粉、粗粉、中粉和細粉)制得的續(xù)斷煮散顆粒進行煎煮考察，結(jié)果表明當(dāng)續(xù)斷粉碎成中粉和細粉時較易制粒，且顆粒飽滿、色澤均勻，且容易濾過;通過對中粉和細粉制成的續(xù)斷煮散顆粒煎煮過程中川續(xù)斷皂苷Ⅵ溶出率和干膏收率的考察，續(xù)斷飲片粉碎成中粉后進行制粒，出粉率較高，川續(xù)斷皂苷Ⅵ含有量和干膏收率較高，具有較好的重復(fù)性和可操作性。故本研究選擇續(xù)斷中粉制得的煮散顆粒作為研究對象。

藥材粒度在很大程度上會影響中藥浸提過程中的滲透和擴散階段，飲片粉碎后粒徑大幅度減小，溶劑易于滲入顆粒內(nèi)部，成分?jǐn)U散速率增大，浸提過程加快。此為煮散顆粒能顯著性提高飲片煎出效率的科學(xué)內(nèi)涵。研究發(fā)現(xiàn)，單味飲片制備成煮散顆粒之后，其浸提效果相較于傳統(tǒng)飲片有顯著提高，故煎煮質(zhì)量更高［11-13］。

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