齊學(xué)潔， 姚 娜， 任應(yīng)宗， 崔元璐*

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津300193;2 天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津300193;3. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津300193)

梔子豉湯出自張仲景的《傷寒論》，功效清熱除煩，主治發(fā)汗吐下后，余熱郁于胸膈，身熱懊憹，虛煩不得眠，胸脘痞悶［1］。課題組根據(jù)古方中梔子先煎，豆豉后下的記載，開展了梔子豉湯中抗抑郁成分的相關(guān)研究，通過藥效學(xué)實驗證實京尼平-酪氨酸衍生物在較小劑量時即可顯示出抗抑郁作用，提示梔子豉湯中生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物京尼平-酪氨酸衍生物可能是其抗抑郁作用的有效成分［2］。

京尼平屬于環(huán)烯醚萜類化合物，具有保肝利膽［3］、抗炎［4-5］、抗氧化［6］、抗血栓形成的藥理作用［7］。因其細(xì)胞毒性小、生物相容性好、抗降解能力強等特點作為新型交聯(lián)劑被廣泛應(yīng)用于生物材料中［8-9］。淡豆豉是大豆的發(fā)酵產(chǎn)品，其中存在大量的β-葡萄糖糖苷酶和以酪氨酸為主的豐富氨基酸［10］。有文獻(xiàn)報道，京尼平可以與含氨基基團的化合物發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成京尼平-氨基酸衍生物［11-13］。因此本研究以京尼平和酪氨酸為反應(yīng)原料，以單因素試驗為基礎(chǔ)，采用正交設(shè)計方法對梔子豉湯中的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物京尼平-酪氨酸衍生物的制備工藝進行研究，為梔子豉湯的抗抑郁研究提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

WH210 磁力攪拌器(德國Wiggenhauser 集團公司);FA1004 分析天平(上海天平儀器廠);DU-800 核酸蛋白分析儀(美國貝克曼公司);Perkin-Elmer spectrum10 紅外光譜儀(美國鉑金埃爾默公司);Jade 差示掃描量熱分析儀(美國Perkin Elemer 公司);Rigaku D/max-2500X 射線衍射儀(日本Rigaku 公司);京尼平(98%，臨川之信生物科技有限公司);酪氨酸(美國Sigma-Aldrich 公司);磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、醋酸(天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠);實驗用水均為MilliQ 級純水(由美國Millipore 公司MilliQ純水機制備制備)。

2 方法與結(jié)果

2.1 京尼平-酪氨酸衍生物制備的單因素試驗

2.1.1 反應(yīng)液pH 值考察 固定京尼平與酪氨酸物質(zhì)的量比為1.0 ∶1.0，調(diào)節(jié)緩沖溶液的pH 分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，60 ℃下恒溫攪拌反應(yīng)5 h，測定京尼平-酪氨酸衍生物在590 nm［2，14］下的吸光度。當(dāng)反應(yīng)的pH 為6.0時京尼平-酪氨酸衍生物的吸光度值最大，因此將pH6.0 確定為京尼平與酪氨酸反應(yīng)的最適pH 條件。

2.1.2 反應(yīng)溫度考察 固定京尼平與酪氨酸物質(zhì)的量比為1.0 ∶1.0，pH=6.0，分別在40、50、60、70 和80 ℃條件下恒溫攪拌反應(yīng)5 h，測定反應(yīng)產(chǎn)物在590 nm 的吸光度。當(dāng)反應(yīng)溫度為70 ℃時京尼平-酪氨酸衍生物的吸光度值最大，因此確定70 ℃為京尼平與酪氨酸的最適反應(yīng)溫度。

2.1.3 反應(yīng)時間考察 固定京尼平與酪氨酸物質(zhì)的量比為1.0 ∶1.0，pH=6.0，70 ℃下恒溫攪拌反應(yīng)4、5、6、7 和8 h，測定反應(yīng)產(chǎn)物在590 nm 的吸光度。當(dāng)反應(yīng)5 h 時京尼平-酪氨酸衍生物的吸光度值最大，因此將5 h 確定為京尼平與酪氨酸的最適反應(yīng)時間。

2.1.4 反應(yīng)物質(zhì)的量比考察 控制京尼平與酪氨酸物質(zhì)的量比分別為1.0 ∶1.0、1.0 ∶1.5、1.0 ∶2.0 和1.0 ∶2.5，pH=6.0，70 ℃下恒溫反應(yīng)5 h，測定反應(yīng)產(chǎn)物在590 nm的吸光度。當(dāng)京尼平與酪氨酸物質(zhì)的量比為1.0 ∶1.5 時反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度值最大，因此將1.0 ∶1.5 確定為京尼平與酪氨酸的最適反應(yīng)物質(zhì)的量比。

2.2 京尼平-酪氨酸衍生物制備的正交試驗 以單因素試驗為基礎(chǔ)，在最佳試驗條件上、下每組選擇三個水平，設(shè)計四因素三水平的正交試驗表，如表1 所示，按表1 的正交實驗因素及水平，所得正交試驗數(shù)據(jù)和方差分析結(jié)果分別見表2 和表3。

表1 正交試驗因素及水平

正交試驗結(jié)果如表2 所示，不同因素水平對京尼平-酪氨酸衍生物的影響強弱順序為:A3＞A2＞A1;B3＞B2＞B1;C1＞C2＞C3;D2＞D3＞D1。結(jié)合表3 的方差分析結(jié)果，反應(yīng)液pH 和物質(zhì)的量比對京尼平-酪氨酸衍生物的生成有極顯著性影響(P ＜0.01)，反應(yīng)時間對產(chǎn)率有顯著性影響(P ＜0.05)。所以京尼平-酪氨酸衍生物的最佳制備工藝為B3A3D2C1，即控制京尼平與酪氨酸物質(zhì)的量之比為1.0 ∶2.0，pH=7.0，60 ℃恒溫攪拌5 h。重復(fù)性驗證試驗的結(jié)果表明該制備工藝穩(wěn)定、可重復(fù)，見表4。

2.3 京尼平-酪氨酸衍生物驗證

2.3.1 紅外光譜(FT-IR)分析 用KBr 將京尼平、酪氨酸、京尼平-酪氨酸衍生物及物理混合物分別壓片，在4 000 ～400 cm-1范圍內(nèi)進行紅外光譜測試。各物質(zhì)的特征紅外吸收如圖1 所示，游離京尼平(a)在3 398，3 237，1 682，1 622，1 443 和1 300 cm-1處具有強吸收峰，屬于京尼平的特征吸收峰。酪氨酸(b)的特征吸收峰在3 205，2 599 ～3 127 (氨基酸羧基的寬峰)，1 590，1 330，1 042和841 cm-1。京尼平-酪氨酸的物理混合物(d)的紅外譜圖是京尼平(a)和酪氨酸(b)特征吸收峰的疊加，而京尼平-酪氨酸衍生物(c)的各譜峰強度明顯降低或消失，物質(zhì)特征峰的變化說明衍生物的形成。

表2 正交試驗結(jié)果L18(37)

表3 方差分析

表4 驗證試驗結(jié)果

2.3.2 差示掃描量熱(DSC)分析 將京尼平、酪氨酸、京尼平-酪氨酸衍生物和物理混合物分別封閉置于鋁盤中，調(diào)溫速度為10 ℃/min，升溫范圍為30 ～350 ℃，分別記錄各樣品的差示熱掃描升溫曲線。由圖2 可知，京尼平(a)在125.0 ℃出現(xiàn)一個尖銳的特征峰。酪氨酸 (b)在315.5 ℃出現(xiàn)一個尖銳的特征峰。京尼平與酪氨酸的物理混合物(d)在124.6 ℃和287.1 ℃兩點均出現(xiàn)特征峰，分別是京尼平(a)和酪氨酸(b)的熔點峰。而京尼平-酪氨酸衍生物(c)在199.9 ℃出現(xiàn)新的特征峰，說明有新物質(zhì)生成。

圖1 京尼平(a)、酪氨酸(b)、京尼平-酪氨酸衍生物(c)和物理混合物(d)的紅外光譜圖

圖2 京尼平(a)、酪氨酸(b)、京尼平-酪氨酸衍生物(c)和物理混合物(d)的DSC 圖

2.3.3 X-射線粉末衍射(XRD)分析 室溫，Cu-Ka 靶，掃描速度2 °/min，采樣時間為1 s，掃描范圍5 ° ～50 °，分別對京尼平、酪氨酸、京尼平-酪氨酸衍生物和物理混合物進行X-射線粉末衍射分析。由圖3 可知，京尼平(a)和酪氨酸(b)均有多個特異性結(jié)晶峰產(chǎn)生，京尼平與酪氨酸物理混合物(d)的峰形為京尼平(a)和酪氨酸(b)結(jié)晶峰的疊加，而京尼平-酪氨酸衍生物(c)的衍射圖譜中特征峰已明顯減弱甚至消失，說明形成了新的物質(zhì)。

3 討論

本研究以京尼平和酪氨酸為反應(yīng)原料，京尼平-酪氨酸衍生物在590 nm 處的吸光度作為考察指標(biāo)，優(yōu)化了梔子豉湯中生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物京尼平-酪氨酸衍生物的制備工藝。

圖3 京尼平(a)、酪氨酸(b)、京尼平-酪氨酸衍生物(c)和物理混合物(d)的X-Ray 衍射圖譜

基于單因素試驗，在最佳試驗條件上、下每組選擇三個水平，設(shè)計了四因素三水平的L9(34)正交試驗表，而該設(shè)計中因沒有空白列，選擇極差較小的列作為誤差列進行方差分析，所有因素與誤差列相比均沒有達(dá)到顯著性，因此本研究選用L18(37)正交表設(shè)計試驗。通過正交試驗確定了京尼平-酪氨酸衍生物的最佳制備工藝條件為:京尼平和酪氨酸物質(zhì)的量比為1.0 ∶2.0，在pH 為7.0 的條件下，60 ℃恒溫水浴攪拌5 h。

京尼平-酪氨酸衍生物經(jīng)冷凍干燥，使用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、差示掃描量熱(DSC)分析和X-射線粉末衍射(XRD)分析方法進行了驗證。結(jié)果顯示，與物理混合物及反應(yīng)原料相比，衍生物呈現(xiàn)出另外一種新的物相特征，確認(rèn)京尼平-酪氨酸衍生物已經(jīng)形成。

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