潘 正， 毛 慶， 江 生， 范 剛， 張 藝

(1. 成都中醫(yī)藥大學民族藥學院，四川成都611130;2. 重慶市食品藥品檢驗所，重慶401121)

達布巴系藏醫(yī)藥學臨床常用藥材，別名達巴巴、吉布孜、達干木等，唇形科獨一味屬植物獨一味Lamiophlomis rotata (Benth.)Kudo 是其來源之一;獨一味分布于不丹、印度、尼泊爾和中國的西藏、青海、甘肅、云南等地，生長于海拔3 000 m以上的石質(zhì)高山草甸、河灘地，是藏、蒙古、納西等少數(shù)民族常用草藥［1-2］。獨一味膠囊主要用于病人的切口疼痛、出血及手術(shù)后，但由于采挖地下部分破壞草地，近年來禁止采挖全草，獨一味為植株的干燥地上部分，以保護高寒草地的生態(tài)環(huán)境［3］。獨一味止血潛在市場需求還在急劇擴大，野生資源品質(zhì)面臨更大的壓力。

獨一味主要含有黃酮、環(huán)烯醚萜、苯乙醇苷、揮發(fā)油及其他類成分［4-6］，上述成分中，環(huán)烯醚萜類、黃酮類和苯乙醇苷是獨一味的主要活性成分［7-9］。近年來，針對上述三類成分，國內(nèi)學者進行了多種該分析方法的研究，分析方法集中于HPLC、HPLC-PAD、HPLC-PAD-MS 等［10-14］，但上述方法有一定局限性，樣品測試時間長，不能全面反映藥材或制劑的品質(zhì)。

1H-NMR 技術(shù)的代謝物組學研究天然藥物的品種鑒定、質(zhì)量評價、化學分類學及產(chǎn)地溯源等研究領(lǐng)域具有多方面的優(yōu)勢。該方法單次測量就能同時檢測分析藥用植物中的多個主要組成成分;樣品預處理步驟簡單;測定快速準確;專屬性強。本實驗采用基于氫核磁共振的代謝物組學技術(shù)，建立了獨一味的整體代謝指紋圖譜，該研究對于獨一味的鑒定、產(chǎn)地判別、質(zhì)量控制與評價、品種鑒別及其臨床合理利用等都將有重要的指導作用。

1 儀器與試藥

Varian Mercury Plus 400 MHz 核磁共振波譜儀(美國Varian 公司，第三軍醫(yī)大學-重慶化醫(yī)集團控股公司聯(lián)合實驗室);Sartorius BP221S 電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司);KQ-300B 型超聲波清洗器(鄭州鞏義市英峪儀器廠);氘代甲 醇 (CD3OD，99.8%)、氘 代 三 氯 甲 烷(CDCl3，99.8%)、重水 (D2O，99.9%)和氘代丙酮(acetone-d6，99.9%)均購自北京京云重輕科技有限公司;8-O-乙酰山梔苷甲酯 (純度98.63%)、毛蕊花糖苷(純度為98.12%)均為本實驗室自制，經(jīng)HPLC 測試，面積歸一化法計算純度，UV、NMR 光譜測試確認其結(jié)構(gòu)。

獨一味藥材均采于2012 年7 月—8 月，樣品由甘南百草生物科技開發(fā)有限公司采集，由張藝研究員鑒定為唇形科獨一味屬植物獨一味Lamiophlomis rotata (Benth.)Kudo 的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器條件 供試液在25 ℃，35%濕度環(huán)境下Varian 400 兆NMR 儀上測定。質(zhì)子觀察頻率400.64 MHz，采用弛豫時間編輯 (Carr. Purcell-Meiboom. Gill)脈沖序列，脈沖延遲時間 (d1)為1 s，譜線寬度(lb) =0.3;譜寬6 kHz，為了增大信噪比，取128 次的掃描次數(shù)，F(xiàn)ID 信號采集時間(at) =2.78;FID 轉(zhuǎn)換所需點數(shù)為65536;調(diào)用水峰壓制序列(Presat)壓制殘余水峰，總測定時間為11 min 22 s。在25 ℃時取一定量供試液溶解于0.5 mL 氘代甲醇溶劑中，TMS 為內(nèi)標，測定獨一味樣品的1H-NMR 圖譜。

2.2 供試溶液的制備 精密稱取干燥的甘肅瑪曲馬場產(chǎn)獨一味粉末約100.0 mg，置于2 mL EP 管中，分別加入0.8 mL CD3OD，超聲提取30 min，離心(10 000 r/min);取上清液以0.22 μm 微孔濾膜過濾，加入0.6 mL 至標準的5 mm 核磁管中，備用。

2.31H-NMR 譜圖處理 核磁圖譜采用MestReNova (Version:6.1.0-6224)傅立葉變換處理，以TSP 的化學位移為標準對譜圖進行校正并進行相位、基線調(diào)整處理。將δ 0.00 ～8.00 范圍按照0.04 為最小間隔積分，對數(shù)據(jù)進行歸一化處理。再對數(shù)據(jù)進行ASCⅡ標準化，除去因交叉弛豫引起峰型變寬的殘余水峰，最終得到186 段數(shù)據(jù)，代表186 個變量進行相似度分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度 精密稱取同一批甘肅瑪曲馬場供試品，按照“2.2”項制備供試樣品液。1H-NMR 波譜連續(xù)測定6 次，按“2.3”項下所述方法處理圖譜，得到6 組積分值數(shù)據(jù)，以第一組數(shù)據(jù)為共有模式，通過Excel 軟件計算數(shù)據(jù)之間的夾角余弦值，分別為1.000、0.996、0.995、0.996、0.999 和0.997，均大于0.995，實驗結(jié)果顯示儀器測量精密度良好。

2.4.2 重復性 精密稱取同一批藥材粉末6 份，每份100.0 mg，按照“2.2”項制備供試樣品液。再按上述方法分別進行1H-NMR 測定和數(shù)據(jù)處理，按“2.3”項處理圖譜，得到6 組積分值數(shù)據(jù)，以第一組數(shù)據(jù)為共有模式，通過Excel 軟件計算數(shù)據(jù)之間的夾角余弦值，分別為 1.000、0.996、0.998、0.995、0.996 和0.997，均在0.995 以上，說明樣品制備方法具有很好的重復性。

2.4.3 穩(wěn)定性 精密稱取同一批甘肅瑪曲馬場供試品，按照“2.2”項制備供試樣品液。分別在0、4、8、12、16、20 h 連續(xù)進行1H-NMR 測定6 次，按“2.3”項處理圖譜，得到6 組積分值數(shù)據(jù)，以第1 組數(shù)據(jù)為共有模式，通過Excel 軟件計算數(shù)據(jù)之間的夾角余弦值，分別為 1.000、0.995、0.997、0.997、0.999、099 5 和0.997，均大于0.995，結(jié)果顯示在常溫實驗條件下20 h 內(nèi)測定供試樣品溶液穩(wěn)定性良好。

2.5 圖譜信號歸屬 采用“加標定性試驗”、以及與文獻［5，7，9，13］數(shù)據(jù)比對的方法進行獨一味供試品1H-NMR 指紋圖譜的信號歸屬。

3 討論

3.1 樣品提取溶劑的考察 取同一批藥材4 份(甘肅瑪曲馬場)，分別以CDCl3、CD3OD-D2O(0.7 ∶0.3，V/V)、acetone-d6和CD3OD 為提取溶劑制備供試品溶液，進行1H-NMR 測定，觀察每個溶劑體系的提取效率，結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取溶劑的1H-NMR 測定結(jié)果比較Fig.1 1H-NMR Spectra of different solvent extractions

結(jié)果表明，CDCl3和acetone-d6能提取出更多的低極性代謝物，如脂肪酸類成分，但是二者對次生代謝產(chǎn)物的提取效率卻很低。CD3OD 和CD3OD-D2O 體系都能提取出更多的次生代謝產(chǎn)物，CD3OD-D2O 能提取出更多的糖類成分，但峰信號在δ3.0 ～4.0 之間重疊嚴重，CD3OD 峰信號整體重疊較CD3OD-D2O 輕，但信號強度較CD3OD-D2O 弱，但可以通過增加樣品的質(zhì)量提高提取溶液濃度消除信號較弱的缺點，綜合各種因素考慮，最終選擇CD3OD 為樣品溶液制備的提取溶劑。

3.2 藥材提取物1H-NMR 譜的代謝物鑒定 以甘肅瑪曲產(chǎn)獨一味地上部分為研究對象，進行1HNMR 信號歸屬及代謝物鑒定。從1H-NMR 譜圖中可以獲取樣品中不同物質(zhì)的化學位移、耦合常數(shù)、裂分情況以及譜峰面積比例等相關(guān)信息，其中根據(jù)化學位移可初步判斷該質(zhì)子所處的化學基團種類，以及“加對照品定性試驗”和對比文獻數(shù)據(jù)，幫助物質(zhì)結(jié)構(gòu)的確定。如圖2 所示，樣品氫譜顯示δ7.32 (1H，s)為與羰基共軛的烯氫質(zhì)子，δ5.56(1H，d，J=4.0 Hz)為與兩個氧相連的次甲基質(zhì)子，與對照品8-O-乙酰山梔苷甲酯的NMR 圖譜吻合，可以構(gòu)建8-O-乙酰山梔苷甲酯的代謝物指紋峰。

最終，從獨一味地上部分提取物中共鑒定出10 個化合物(表1)，5 個環(huán)烯醚萜苷類化合物，3個苯丙素類化合物和2 個糖類化合物。其中:環(huán)烯醚萜苷類化合物為山梔苷甲酯，8-O-乙酰山梔苷甲酯，6-O-乙酰山梔苷甲酯，胡麻屬苷，Phlorigidoside C;苯丙素類化合物為木犀草苷，連翹酯苷B和毛蕊花糖苷;兩種糖類化合物為α-葡萄糖和β-葡萄糖。

表1 獨一味代謝產(chǎn)物1H-NMR 信號歸屬特征信號峰及耦合常數(shù)Tab.1 1H-NMR chemical shifts and coupling constant of L. rotate metabolites

獨一味地上部分的一維1H-NMR 譜見圖2。

圖2 獨一味氘代甲醇提取物1H-NMR 指紋圖譜中代謝產(chǎn)物信號歸屬Fig.2 Representative 1H-NMR spectra (CD3OD)of Lamiophlomis rotate methanol extract and metabolites are classified

4 結(jié)論

獨一味中的黃酮類成分和苯乙醇苷類成分，全波長紫外吸收圖譜比較接近，紫外分光光度法很難準確測定出總黃酮類或苯乙醇苷類成分，HPLC 或HPLC-MS 等方法可以通過化合物的保留時間和相應面積，對樣品中的兩類成分定性定量，但色譜柱品牌不同，儀器或?qū)嶒炇覘l件不同，結(jié)果難免產(chǎn)生偏差。實驗基于1H-NMR 譜的獨一味地上部分測試，可檢測分析獨一味中10 個主要組成成分。同時供試品溶液制備簡單，樣品測定快速，1H-NMR方法具有很好的普適性、耐用性和重復性。

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