李 磊， 程虹毓， 朱玉野， 曾金祥， 羅光明， 朱繼孝*

(1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心，江西 南昌330004;2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)人文學(xué)院，江西南昌330004)

梔子柏皮湯始記于《傷寒論》，復(fù)方由梔子、黃柏和甘草三味藥組成，為治療濕熱內(nèi)阻、熱重于濕之陽(yáng)黃證的經(jīng)方［1］之一。現(xiàn)代藥理研究表明，該方具有明顯的保肝利膽作用［2-4］，臨床常用此方治療黃疸。然而，目前國(guó)內(nèi)對(duì)于梔子柏皮湯的提取工藝的研究報(bào)道較少，為了建立較完備、全面的梔子柏皮湯提取工藝，提高其有效成分的含有量和臨床療效，本實(shí)驗(yàn)以梔子苷、甘草苷、西紅花苷-Ⅰ、鹽酸小檗堿的含量和浸膏得率作為綜合評(píng)分指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化梔子柏皮湯的提取工藝參數(shù)，為研發(fā)可行、穩(wěn)定和質(zhì)量可控的梔子柏皮湯提取工藝提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，包括2695 溶劑管理系統(tǒng)、2996 DAD 檢測(cè)器，Empower 工作站;BP224S 電子天平(萬(wàn)分之一)(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);KQ-250超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 對(duì)照品梔子苷 (批號(hào)110749-200714)、鹽酸小檗堿(批號(hào)110713-200911)和甘草苷(批號(hào)111610-201005)，均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，對(duì)照品西紅花苷-Ⅰ(批號(hào)1175-060709)購(gòu)自江西中醫(yī)學(xué)院中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心;梔子、黃柏、甘草均購(gòu)自江西省黃慶仁棧華氏大藥房總店 (批號(hào)分別為1208002、1207004、1301001)并經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)羅光明教授鑒定;乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)NK 公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 預(yù)實(shí)驗(yàn)比較了不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇超聲提取、回流提取，不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇超聲提取、回流提取、水超聲提取，最終選擇70%乙醇回流法提取。選取浸泡時(shí)間、溶媒用量、提取次數(shù)和提取時(shí)間為考察因素，因素水平見(jiàn)表1。

2.2 有效化學(xué)成分含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫(A 相梯度:0 ～15 min 12% ～26%;15 ～34 min 26% ～31%;34 ～35 min 31% ～40%;35 ～44 min 40% ～60%;44 ～46 min 60% ～100%)。體積流量0.8 mL/min;柱溫30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm (梔子苷和甘草苷)、265 nm (鹽酸小檗堿)、440 nm (西紅花苷-Ⅰ);進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

圖1 梔子柏皮湯樣品在238、265、440 nm 處色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Zhizi Baipi Decoction at 238、440、265 nm

2.2.2 樣品溶液的制備 分別稱(chēng)取梔子、黃柏和甘草中粉4.0、2.4、1.2 g，按正交設(shè)計(jì)用70%乙醇進(jìn)行回流提取，濾過(guò)，合并濾液，濃縮至10 mL，加70%乙醇定容至250 mL。

2.2.3 干膏率的測(cè)定 精密吸取上述樣品溶液20 mL，置105 ℃已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，50 ℃水浴蒸干，于50 ℃減壓干燥箱內(nèi)干燥至恒質(zhì)量，置干燥器中冷卻至室溫，迅速稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率。

2.2.4 對(duì)照品貯備液及混合對(duì)照品溶液的制備分別取梔子苷、甘草苷、西紅花苷-Ⅰ和鹽酸小檗堿的對(duì)照品適量，用甲醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，質(zhì)量濃度為梔子苷700 μg/mL、甘草苷220 μg/mL、西紅花苷-Ⅰ220 μg/mL 和鹽酸小檗堿170 μg/mL，其中西紅花苷-Ⅰ經(jīng)逐級(jí)稀釋后質(zhì)量濃度為22 μg/mL，最終得各單一對(duì)照品貯備液;分別精密移取上述4 種貯備液1.3、0.4、1、0.7 mL，置同一5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液，使用前用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾。

2.2.5 線性關(guān)系考察 取“2.2.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按照上述“2.2.1”色譜條件下分別進(jìn)樣6、16、26、36、46 μL，測(cè)定梔子苷、甘草苷、西紅花苷-Ⅰ、鹽酸小檗堿等4 種成分最佳檢測(cè)波長(zhǎng)下的峰面積，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣對(duì)照品質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，其結(jié)果線性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 梔子柏皮湯中4 種成分的線性回歸方程Tab.2 Linear regression equation about four constituents

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取同一份混合對(duì)照品溶液10 μL，按照上述“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積。梔子苷、甘草苷、西紅花苷-Ⅰ和鹽酸小檗堿的RSD 在1.1% ～2.4%之間(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取配置好同一供試品溶液，分別于樣品制備后的0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣20 μL，測(cè)峰面積，梔子苷、甘草苷、西紅花苷-Ⅰ和鹽酸小檗堿的RSD 在1.3% ～2.1%之間(n =6)，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批復(fù)方中藥材，制備6 份供試品溶液，測(cè)峰面積并計(jì)算梔子苷、甘草苷、西紅花苷-Ⅰ和鹽酸小檗堿的含有量，結(jié)果梔子苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)、甘草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)、西紅花苷-Ⅰ質(zhì)量分?jǐn)?shù)和鹽酸小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 在1.1% ～1.9%之間(n=6)，表明此法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含有量的樣品制備成供試樣品，共計(jì)6 份，精密加入2 mL混合對(duì)照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)樣10 μL，依法測(cè)定梔子苷、甘草苷、西紅花苷-Ⅰ和鹽酸小檗堿的峰面積并計(jì)算平均加樣回收率，平均回收率分別為100.0%、100.1%、98.4%、99.8%，RSD 分 別 為 0.8%、1.6%、2.3%、1.0%，表明此方法回收率較好。

綜合評(píng)分=干膏得率×100 ×0.05 + (梔子苷含量/梔子苷最大含量) ×100 ×0.32 + (甘草苷含量/甘草苷最大含量) ×100 ×0.14 + (西紅花苷-Ⅰ含量/西紅花苷-Ⅰ最大含量)×100 ×0.26 +(鹽酸小檗堿含量/鹽酸小檗堿最大含量)×100 ×0.23。

利用SPSS 19.0 對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3、方差見(jiàn)表4。由結(jié)果分析可知，綜合加權(quán)評(píng)分法得出各因素對(duì)提取工藝的影響大小順序?yàn)锽 ＞A ＞D ＞C，優(yōu)化的工藝組合為A3B3C3D2;方差分析可知，因素A、B、C、D 對(duì)提取工藝具有顯著的影響(P ＜0.01)。綜合分析得出最佳提取工藝為A3B3C3D2，即用12 倍量70%乙醇浸泡1 h，提取3 次，每次1.5 h。

2.3 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按照處方量比例稱(chēng)取同一批梔子、黃柏和甘草中粉分別4.0、2.4、1.2g，平行3 份，按照優(yōu)化的工藝進(jìn)行提取。結(jié)果平均浸膏率為27.1%，RSD 為0.8%;梔子苷、西紅花苷-Ⅰ和鹽酸小檗堿平均含量分別為2.34%、0.21%、0.05%、0.32%，RSD 分別為2.2%、0.9%、1.2%、2.0%，表明該最佳工藝穩(wěn)定可行。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Result of orthogonal test

表4 綜合評(píng)分方差分析Tab.4 Comprehensive analysis of score variance

3 討論

中藥復(fù)方以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，體現(xiàn)了中醫(yī)整體論治的特點(diǎn)，其生物活性物質(zhì)為主成分群［6］。梔子柏皮湯中主要含環(huán)烯醚萜類(lèi)、藏紅花素、有機(jī)酸類(lèi)和生物堿類(lèi)化合物，優(yōu)化提取工藝過(guò)程中，應(yīng)充分考慮成分之間相互作用的影響，如產(chǎn)生沉淀、發(fā)生水解、絡(luò)合反應(yīng)等。現(xiàn)代藥理研究表明梔子柏皮湯中梔子苷、甘草苷、西紅花苷-Ⅰ和鹽酸小檗堿具有明顯的保肝利膽作用［7-10］，且其化學(xué)研究較為充分，因而將4 種成分與干膏得率共同作為檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定。多指標(biāo)成分的評(píng)價(jià)相對(duì)于單一指標(biāo)成分，更能反映復(fù)方的整體性、復(fù)雜性和有效性。高效的正交設(shè)計(jì)方案實(shí)驗(yàn)，以多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法優(yōu)化復(fù)方的提取工藝，使試驗(yàn)次數(shù)減少、數(shù)據(jù)點(diǎn)均勻分散，可保證實(shí)驗(yàn)結(jié)論的穩(wěn)定性與可靠性。

多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法中權(quán)重系數(shù)的賦予是綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是否科學(xué)、合理的直接體現(xiàn)［11］。采用AHP 法賦權(quán)，梔子苷、鹽酸小檗堿、西紅花苷-Ⅰ、甘草苷和干浸膏的權(quán)重系數(shù)為0.433、0.281、0.158、0.082、0.046，可體現(xiàn)出復(fù)方君臣佐使的配伍規(guī)律:梔子苷為君藥梔子中保肝主成分，賦權(quán)最大;鹽酸小檗堿為臣藥黃柏中保肝主成分，賦權(quán)次之;西紅花苷-Ⅰ為君藥梔子中保肝成分，甘草苷為使藥甘草中保肝成分，但二者在復(fù)方中的含量較低，賦權(quán)較小;采用CRITIC 法賦權(quán)，梔子苷、鹽酸小檗堿、西紅花苷-Ⅰ、甘草苷和干浸膏的權(quán)重系數(shù)為0.124、0.140、0.280、0.286、0.170，僅通過(guò)各數(shù)據(jù)的變異性和各指標(biāo)的相關(guān)性來(lái)客觀反應(yīng)樣本數(shù)據(jù)的信息，未體現(xiàn)配伍規(guī)律。因此，本實(shí)驗(yàn)采用AHP 法結(jié)合CRITIC 法來(lái)指導(dǎo)指標(biāo)綜合權(quán)重的確立，該法從主客觀角度綜合考慮梔子柏皮湯配伍規(guī)律、數(shù)據(jù)的變異性和指標(biāo)間的相關(guān)性，能更好地區(qū)分樣本數(shù)據(jù)和客觀評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，均衡評(píng)估信息量的實(shí)際重要程度，從而確保綜合評(píng)價(jià)結(jié)果的合理性和科學(xué)性。

現(xiàn)僅有文獻(xiàn)對(duì)梔子柏皮湯水浸液提取工藝均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)報(bào)道［12］，本實(shí)驗(yàn)在正交試驗(yàn)前，進(jìn)行了以水、不同體積分?jǐn)?shù)乙醇和甲醇為溶劑的單因素考察，對(duì)提取工藝的因素和水平進(jìn)行了初步的篩選工作，結(jié)果表明70%乙醇提取液的指標(biāo)成分含量高于水、甲醇及其他體積分?jǐn)?shù)乙醇提取液中的成分含量，因此實(shí)驗(yàn)確定以70%乙醇作為提取溶劑。

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