李存玉， 錢 祥， 楊澤秋， 陳偉偉， 李紅陽， 彭國平*

(1. 南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京210023;2. 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210023)

消癌平注射液是以單一藥材通關藤為原料，經(jīng)過水提取、精制而成的中藥注射劑，具有清熱解毒，化痰軟堅的功效，多用于治療肝癌、肺癌、胃癌、食道癌等，多作為放療、化療的輔助治療藥物使用，臨床使用量較大，是一種效果較好的抗癌藥物［1］。但是，借助中藥注射液安全性再評價的契機，在對消癌平注射液進行工藝優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，其生產(chǎn)過程中常常出現(xiàn)鉀離子濃度偏高的現(xiàn)象，危害著其用藥安全性。

鉀離子普遍存在于中藥材中，當作為靜脈給藥時，鉀離子濃度過高容易造成機體電解質平衡失調，對心肌的損傷很大［2］。因此，《中國藥典》2010 版規(guī)定靜脈注射液中鉀離子質量濃度不得超過22% (mg/mL)［3］。消癌平注射液中鉀離子的超標直接是由其原料藥材通關藤所引入的，因此需要在通關藤藥材提取、濃縮等工藝環(huán)節(jié)中采取適宜的方法降低鉀離子的含量，提升注射劑的質量安全。

目前鉀離子的去除方法主要分為陽離子交換樹脂法、電滲析法［4］，二者均能有效的去除藥液中的鉀離子，但是均存在成分吸附損失的問題，因此在中藥注射液生產(chǎn)中存在應用瓶頸。而納濾是介于超濾和反滲透之間的一種膜分離技術，截留分子量在200 ～1 000 Da 之間，具有操作壓力低，通量高，對無機離子高效去除的能力，目前在制藥、生物化工、食品、水處理等諸多領域廣泛應用［5-8］。

為了在降低消癌平注射液中的鉀離子濃度的同時，保留其有效成分，本研究選擇系列截留分子量的納濾膜進行消癌平注射液中間體納濾處理，以鉀離子的去除和有效成分綠原酸的保留為指標，優(yōu)選適宜于中藥注射劑中鉀離子的去除工藝。

1 材料與方法

1.1 材料 通關藤飲片(批號20100130，由南京圣和藥業(yè)有限公司提供)，納濾膜(截留分子量150 ～300 Da、300 ～500 Da、600 ～800 Da，聚酰胺復合膜，星達(泰州)膜科技有限公司)，綠原酸對照品(批號110753-200212，中國食品藥品檢定研究院)，鉀離子標準溶液(國家標準物質中心)，乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水。

1.2 儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀(VWD檢測器，美國Agilent LC 公司);TAS-986 火焰原子吸收分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);納濾膜分離設備(型號TNZ-1，南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司);不銹鋼煎藥桶(容量50 L)，燃氣為高純度乙炔氣，空氣為助燃氣。

1.3 方法

1.3.1 消癌平注射液中間體的制備 按照消癌平注射液質量標準制法，取通關藤飲片5.0 kg，加水(8、5、5 倍)煎煮3 次，第1 次1.5 h，第2 次1 h，第3 次0.8 h，提取液分別濾過，合并濾液，得消癌平注射液中間體約80 L。

1.3.2 納濾工藝 取消癌平注射液中間體40 L，取樣為原液，分別采用3 種不同截留分子量的納濾膜濃縮(納濾膜參數(shù)見表1)，操作壓力5 kg/cm2、溫度25 ℃，納濾濃縮過程如圖1 所示，將進液端與截留液端均置于原液中，隨著納濾的進行，根據(jù)最終可生產(chǎn)的消癌平注射液成品量，在原液濃縮至體積在4 L 左右時，加入3 倍體積純凈水繼續(xù)納濾，重復3 次，將濃縮液定容至4 L，取樣為納濾濃縮液。

表1 納濾膜參數(shù)Tab.1 Parameters of nanofiltration membrane

圖1 納濾膜過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of nanofiltration process

1.3.3 綠原酸檢測［9-10］

1.3.3.1 綠原酸對照品溶液的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL 含40 μg 的綠原酸對照品溶液，即得。

1.3.3.2 HPLC 色譜條件 色譜柱:Thermo scientific C18色譜柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);柱溫25 ℃;檢測波長327 nm;體積流量1 mL/min;進樣量10 μL;流動相乙腈-0.4% 磷酸水溶液 (9-91)。

1.3.3.3 綠原酸保留率測定 分別精密吸取綠原酸對照品溶液、消癌平注射液中間體、納濾濃縮液，按“1.3.3.2”項下的色譜條件，采用高效液相色譜法測定峰面積，采用外標一點法，按式(1)計算綠原酸的保留率。

式中，R 為綠原酸的保留率;CN為納濾濃縮液中綠原酸的質量濃度，單位為μg/mL;VN為納濾濃縮液體積，單位為mL;CT為提取液中綠原酸的質量濃度，單位為μg/mL;VT為提取液體積，單位為mL。

1.3.4 鉀離子的檢測［11］

1.3.4.1 測定條件 檢測波長:768.5 nm，空心陰極燈電流2.0 mA，狹縫為0.2 nm，采用空氣-乙炔火焰，燃氣流量2.5 L/min。

1.3.4.2 線性關系 標準曲線的制備:精密量取質量濃度為0.5 mg/mL 的鉀單元素標準溶液100 mL，為對照品貯備液。

分別精密量取上述對照品貯備液各0、1、2、3、4、5 mL 置25 mL 量瓶中，純化水稀釋制得每1 mL分別含鉀0、20、40、60、80、100 μg 的溶液，依次噴入火焰，測定吸光度，以吸光度Y 為縱坐標，質量濃度X (μg/mL)為橫坐標，進行二次方程最小二乘法擬合回歸，繪制標準曲線。得回歸方程:Y = -0.001 03X2+0.150 22X +0.049 71，r=0.999 8。

1.3.4.3 重復性試驗 按“1.3.4.2”項下方法制備同一批樣品的溶液6 份，平行測定，RSD為1.6%。

1.3.4.4 精密度試驗 取同一份供試品溶液連續(xù)測定6 次，吸收值RSD 為1.1%。

1.3.4.5 回收率試驗 精密量取納濾濃縮液1 mL于25 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述溶液2.5 mL 及對照品貯備液1 mL 于同一25 mL 量瓶中，純化水稀釋至刻度，搖勻，即得加樣回收溶液。平行制備6 份，依法測定，計算回收率。回收率平均值為98.7% (n = 6)，RSD為2.8%。

1.3.4.6 樣品測定 精密量取消癌平注射液中間體(或納濾濃縮液)1 ～10 mL (使供試品溶液吸收值在標準曲線范圍內(nèi))于25 mL 量瓶中，純化水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密吸取空白溶液與供試品溶液，照標準曲線的制備項下方法測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算供試品中鉀的含有量，按式(2)計算鉀離子的去除率。

式中，Q 為鉀離子的去除率;CN＇為納濾濃縮液中鉀離子的質量濃度，單位為μg/mL;VN＇為納濾濃縮液體積，單位為mL;CT＇為提取液中鉀離子的質量濃度，單位為μg/mL;VT＇為提取液體積，單位為mL。

2 結果

2.1 綠原酸的保留率 從表2 數(shù)據(jù)中可以看出，不同截留分子量的納濾膜對綠原酸的保留率表現(xiàn)出一定差異，但是隨著膜孔徑的增大，綠原酸保留率呈現(xiàn)出下降的趨勢，其中截留率分子量小于500 Da 時，綠原酸的保留率均能控制在93%以上，當選用600 ～800 Da 納濾膜時，綠原酸損失明顯，接近20%，高于150 ～300 Da 納濾膜。

2.2 鉀離子的去除率 對比不同孔徑納濾膜的鉀離子去除效果，從表2 數(shù)據(jù)中可以看出，3 種納濾膜中鉀離子均有較高的透過率，均高于74%，但是150 ～300Da 納濾膜濃縮液中鉀離子質量濃度高達383.2 μg/mL，而300 ～500 Da 及600 ～800 Da納濾膜濃縮液中鉀離子質量濃度均低于220 μg/mL，且去除率均高于150 ～300 Da 納濾膜。

表2 不同納濾膜的綠原酸保留率及鉀離子去除率Tab.2 Rates of chlorogenic acid retention and K + removal by different nanofiltration membranes

2.3 鉀離子去除的納濾工藝優(yōu)選 以消癌平注射液中間體中有效成分綠原酸的保留率及鉀離子去除率作為納濾濃縮工藝優(yōu)選的評價指標，但是分析表2 中數(shù)據(jù)可以得出，綠原酸的保留和鉀離子的去除是一對難以解決的技術矛盾，在保障注射劑中鉀離子質量濃度小于《中國藥典》2010 版規(guī)定(220 μg/mL)時的同時，可以選擇截留分子量為300 ～500 Da 及600 ～800 Da 納濾膜，其中600 ～800 Da納濾膜的綠原酸損失明顯，故選擇截留分子量為300 ～500 Da 納濾膜去除消癌平注射液中的鉀離子。

3 討論

消癌平注射液在實際生產(chǎn)中，多采用電滲析法去除通關藤提取液中的鉀離子，但是綠原酸及部分甾體皂苷類成分損失嚴重，而電滲析處理后需要進一步的加熱濃縮，又進而降低了有效成分綠原酸的質量濃度，導致目前存在鉀離子超標的注射劑品種，多以有效成分損失為代價來保障注射劑的用藥安全性。

納濾技術具有常溫操作，不破壞熱敏性成分的優(yōu)勢［12］，在消癌平注射液中間體濃縮中具有明顯的技術優(yōu)勢。雖然在離子去除的同時，綠原酸有少量損失，但是與目前常用的電滲析法或離子交換樹脂法比較，則優(yōu)勢明顯。600 ～800 Da 納濾膜對消癌平注射液中間體濃縮時，鉀離子的去除率高達99.3%，雖然綠原酸的保留率在80%左右，但是隨著通關藤提取液的濃縮，濃縮液中綠原酸濃度升高的同時，其膜透過量也會相應提高，損失量增加，因此本實驗中采用“濃縮液中加入3 倍體積純凈水繼續(xù)納濾，重復3 次”的納濾濃縮方法，如果減少藥液的稀釋倍數(shù)與重復納濾次數(shù)，綠原酸的損失會下降，但是鉀離子的去除效率則難以保證，但是增加藥液的稀釋倍數(shù)與重復納濾次數(shù)，在引起有效成分損失的同時，生產(chǎn)效率也會大幅降低。

雖然納濾技術在中藥制劑生產(chǎn)中的濃縮應用尚處于起步階段，但是其具有良好的應用前景，在去除有害物質的同時，提升中藥注射劑質量。但是，隨著納濾技術的逐步推廣，首先需要考慮納濾膜在使用中膜材質與藥液之間的兼容性，不能因為膜材質的脫落危害注射劑的安全性，從而限制了納濾技術的推廣應用;其次納濾膜使用方法的規(guī)范性，從而保證注射劑產(chǎn)品質量的均一性。納濾技術的種種優(yōu)勢決定了其應用潛力，但是在實際的推廣中必須根據(jù)中藥提取液中成分的結構特點，選擇適宜的納濾濃縮方式。

［1］ 李邇娜，王 芳，欽 松，等. 消癌平注射液抗腫瘤作用機制研究進展［J］. 中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19(9):111-112.

［2］ 徐麗君，魏世超，鄒 欣，等. 黃芩注射液去鉀離子工藝研究［J］. 醫(yī)藥導報，2002，S1:11.

［3］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010，附錄ⅠⅩS.

［4］ 鐘躍寬，郝鵬彬，孫晶波，等. 紅花注射液去除鉀離子不同工藝對比研究［J］. 臨床合理用藥，2013，6(4B):31-32.

［5］ 崔崇威，紀 峰，唐小輝，等. 納濾膜法生產(chǎn)桶裝飲用水與提高水資源利用率［J］. 哈爾濱工業(yè)大學學報，2007，39(2):258-261.

［6］ 韓少卿，葉 驥，薛 強，等. 超濾和納濾膜分離技術提取螺旋霉素［J］. 中國抗生素雜志，2005，30(1):52-55.

［7］ 胡立新，崔朝亮，程新華，等. 利用膜分離技術對牛初乳進行除菌濃縮的研究［J］. 食品科技，2007，(3):90-92.

［8］ 牟旭鳳，白慶中，陳紅盛，等. 聚合物輔助超濾/納濾技術處理模擬放射性廢水［J］. 給水排水，2006，32 (S1):174-177.

［9］ 溫瑞卿，李東輝，王 鑫. HPLC 法和聚類分析法探討不同廠家消癌平片中綠原酸含量的一致性和穩(wěn)定性［J］. 中成藥，2011，32(11):2021-2023.

［10］ 溫瑞卿，李東輝，韓 杰，等. 消癌平片中綠原酸測定的影響因素和優(yōu)化研究［J］. 中成藥，2012，34 (4):762-764.

［11］ 聶黎行，金紅宇，林瑞超，等. 原子吸收分光光度法測定紅花注射液中鉀的含量［J］. 藥物分析雜志，2010，30(3):468-470.

［12］ Murakami A N N，Amboni R D M C，Prudêncio E S，et al.Concentration of biologically active compounds extracted from Ilex paraguariensis St. Hil. By nanofiltration［J］. Food Chem，2013，141(1):60-65.