周婧倩， 欽 松， 馬亮亮， 楊 宇， 張 倉， 余伯陽*

(1. 中國藥科大學(xué)，江蘇南京211198;2. 南京圣和藥業(yè)有限公司，江蘇南京210038)

消癌平注射液是由蘿藦科植物通關(guān)藤M(fèi)arsdenia tenacissima (Roxb.)Wight et Arn. 的干燥藤莖經(jīng)水提醇沉制成的中藥注射劑，臨床上常用作肺癌、肝癌、胃癌、食道癌的治療藥物。研究證實(shí)消癌平注射液有明顯的體外抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用［1］，但是尚未見對(duì)消癌平注射液的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究的報(bào)道。前期研究表明通關(guān)藤藥材主要組分為多糖類、酚酸類、甾體苷(元)類［2-4］。本實(shí)驗(yàn)采用中壓制備色譜分離制備三大類組分并通過模擬腫瘤轉(zhuǎn)移的三個(gè)主要步驟:黏附、遷移、侵襲以研究消癌平注射液及其大類組分不同配比下對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用及其對(duì)抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響能力，為進(jìn)一步研究消癌平注射液的抗腫瘤作用、探明其有效成分及其作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 中壓制備色譜MPLC (上海利穗Dr FlashⅡ);Mettler AL104 型分析天平(瑞士Mettler Toledo 公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 公司);酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices 公司);超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司);離心機(jī)80-2B (上海安亭科學(xué)儀器廠制造);倒置顯微鏡 (日本OLYMPUS XSZ-D2)。

1.2 主要藥物及試劑 消癌平注射液(南京圣和藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)分別為201209051，201209101，201208310，201203211，201209071，201210221，201207031，201208231，201209271，201209311，201209281，201202271，201207091，201209171，201209151，201208311，201209042，201207231，201006201，201203151)，胎牛血清(GIBCO)，RPMI 1640 培養(yǎng)液(GIBCO)，0.25%胰蛋白酶(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);噻唑藍(lán)MTT (美國AMRESCO 公司);纖維連接蛋白FN (美國Calbiochem 公司);小牛血清白蛋白BSA(美國羅氏公司);人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel 膠(美國BD 公司)，結(jié)晶紫(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);4%多聚甲醛(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.3 細(xì)胞 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，人肝癌細(xì)胞系BEL-7402，購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

2 方法

2.1 樣品制備 取消癌平注射液20 mL，經(jīng)MPLC洗脫程序?yàn)锳 (水)-B (甲醇):1 ～9 min 0%B;9 ～22 min 30%B;22 ～31 min 70% B;31 ～38 min 100% B。大類組分Ⅰ:收集0 ～9 min 的洗脫液;大類組分Ⅱ:收集9 ～22 min 的洗脫液;大類組分Ⅲ:收集22 ～31 min 的洗脫液。各部分樣品減壓回收溶劑，冷凍干燥后統(tǒng)計(jì)并計(jì)算各部分得率。根據(jù)消癌平注射液中大類組分原固有比例組合得到8組實(shí)驗(yàn)藥物(見表1)。

2.2 MTT 法檢測細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期的兩種細(xì)胞按6 ×104個(gè)/mL 的密度接種于96 孔板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜。分別加入生藥質(zhì)量濃度為2、4、8、16、32、64、128、256 mg/mL 的消癌平注射液，陰性對(duì)照組及空白組加入等體積的1640 培養(yǎng)液，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，置培養(yǎng)箱中孵育48 h 后，每孔加入MTT 100 mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，加入DSMO 150 mL/孔，用酶標(biāo)儀測定OD 值，測定波長570 nm，參比波長650 nm。同法測定3 種大類組分IC50。細(xì)胞增殖抑制率% = (1 -ODtreated/ODcontrol)×100%。

表1 消癌平注射液及其大類組分不同配比藥物編號(hào)Tab.1 Numbers of different compounds

2.3 細(xì)胞黏附能力的檢測 調(diào)整A549、BEL-7402細(xì)胞密度至1 ×106個(gè)/mL，與等體積藥液混合后，以每孔100 mL 加至已包被纖維連接蛋白并水化的96孔板中，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，孵育1.5 h，棄去未黏附的細(xì)胞，用PBS 沖洗1 遍，以MTT 法在酶標(biāo)儀上測定OD 值，測定波長570 nm，參比波長650 nm。黏附抑制率% =(1-ODtreated/ODcontrol)× 100%。

2.4 細(xì)胞體外侵襲能力檢測 將Transwell 小室的上室面加入50 mL Matrigel 稀釋液，放置3 h 后，棄去殘液，每孔加入10 mg/mL BSA 50 mL，水化30 min。用1640 培養(yǎng)液調(diào)整A549、BEL-7402 細(xì)胞密度至1 ×106個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液和藥液等體積混合。Transwell 的上室加入180 mL 混合懸液，下室加入完全培養(yǎng)液650 mL，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。20 h后用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，下表面用4%多聚甲醛固定，用0.1%結(jié)晶紫染色，使用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。小室用10%醋酸100 mL 抽提脫色，在酶標(biāo)儀上600 nm 測其OD 值。侵襲抑制率% = (1 -ODtreated/ODcontrol)×100%。

2.5 細(xì)胞遷移能力檢測 實(shí)驗(yàn)方法與體外侵襲力的檢測相同，只是不在聚碳酸脂膜上鋪Matrigel膠，置培養(yǎng)箱中12 h 后取出。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。

3 結(jié)果

3.1 消癌平注射液及其大類組分對(duì)A549、BEL-7402 細(xì)胞增殖的影響 不同生藥質(zhì)量濃度消癌平注射液處理A549、BEL-7402 細(xì)胞48 h 后，MTT 法測定OD 值，并計(jì)算IC50，結(jié)果顯示消癌平注射液對(duì)A549、BEL-7402 細(xì)胞有明顯的抑制作用，同法測定各大類組分IC50(見表2)。

表2 消癌平注射液及大類組分對(duì)A549、BEL-7402 細(xì)胞增殖影響Tab.2 Effects of Xiaoaiping Injection and its fractions on proliferation of A549 and BEL-7402

3.2 消癌平注射液及其大類組分不同配比組對(duì)A549、BEL-7402 細(xì)胞黏附能力的影響 生藥質(zhì)量濃度為5 ～20 mg/mL 時(shí)，8 組藥物均抑制A549、BEL-7402 細(xì)胞的黏附，且兩種細(xì)胞對(duì)FN 的黏附抑制率隨質(zhì)量濃度的增加而升高 (見圖1)。20 mg/mL 時(shí)，消癌平注射液及原固有比例組對(duì)A549細(xì)胞的最高黏附抑制率分別達(dá)到 (46.41 ±3.65)%、 (43.13 ±0.49)%，但3 ～8 號(hào)藥物對(duì)A549 的黏附抑制率均小于25%，與對(duì)照組比較均有顯著性差異。由兩組圖表可以看出，在2.5 mg/mL時(shí)，大類組分Ⅰ-糖類單用時(shí)幾乎無效;原固有比例組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果無顯著性差異(P ＞0.05)，作用相當(dāng)，并且作用效果均優(yōu)于兩組分合用及單組分用藥。

圖1 8 組藥物對(duì)A549 (A)、BEL-7402 (B)細(xì)胞黏附的影響Fig.1 Effects of eight kinds of tested drugs on adhesion of A549 cells (A)and BEL-7402 cells (B)

3.3 消癌平注射液及其大類組分不同配比對(duì)A549、BEL-7402 細(xì)胞體外侵襲力的影響 圖2 為用倒置顯微鏡拍攝的經(jīng)結(jié)晶紫染色的侵襲到Transwell 小室底部的A549、BEL-7402 細(xì)胞，隨著藥物質(zhì)量濃度的增高，侵襲過基底膜的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，穿過膜的細(xì)胞數(shù)量直觀的體現(xiàn)了1 ～8 號(hào)藥物在生藥質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10 mg/mL 時(shí)對(duì)A549、BEL-7402 細(xì)胞侵襲的抑制能力。10 mg/mL時(shí)，8 組藥物對(duì)A549 細(xì)胞的抑制率分別為80.76%、82.22%、55.65%、57.91%、59.70%、35.40%、45.49%、46.24%;對(duì)BEL-7402 細(xì)胞的抑制率分別為:88.68%、87.97%、62.83%、65.54%、69.57%、41.49%、46.23%、42.25%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，高質(zhì)量濃度時(shí)，8 組藥物對(duì)兩種細(xì)胞的侵襲具有不同程度的抑制作用:原固有配比組高于兩兩配比組，更高于單組分組;低質(zhì)量濃度時(shí)，各組藥物之間無顯著差異，隨著藥物質(zhì)量濃度的增加兩種細(xì)胞的各組數(shù)據(jù)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

圖2 8 組藥物對(duì)A549 (A)、BEL-7402 (B)細(xì)胞侵襲的影響Fig.2 Effects of eight kinds of tested drugs on cell invasion of A549 cells and BEL-7402 cells

3.4 消癌平注射液及其大類組分不同配比對(duì)A549、BEL-7402 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移的影響 8 組藥物對(duì)A549、BEL-7402 細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)趨化的抑制力同樣具有劑量依賴性(見圖3)，在生藥質(zhì)量濃度為15 mg/mL 時(shí)，兩種細(xì)胞的最高遷移抑制率大于50%。對(duì)照組與原固有比例組無顯著差異，其它各組與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

圖3 8 組藥物對(duì)A549 (A)、BEL-7402 (B)細(xì)胞遷移的影響Fig.3 Effects of eight kinds of tested drugs on migration of A549 cells (A)and BEL-7402 cells (B)

4 結(jié)論

消癌平注射液化學(xué)成分復(fù)雜，具有廣泛的藥理活性，特別是其抗腫瘤作用較為明顯，且不良反應(yīng)輕微［5-7］。

本研究從20 批消癌平注射液的不同梯度洗脫液中分離得到三大類化學(xué)組分，經(jīng)HPLC-UV/ELSD 檢測大類組分Ⅰ、大類組分Ⅱ、大類組分Ⅲ為:糖類、酚酸類、甾體類［8-10］，各組得率分別為(59.68 ±1.61)%、(16.93 ±1.53)%、 (14.90 ±0.93)%，統(tǒng)計(jì)消癌平注射液中大類組分原固有配比為(59.68 ±0.62)∶(16.93 ±0.59)∶(4.90 ±0.36)，20 批制備樣品平均總得率為91.50 ±1.62%，說明制備樣品方法的穩(wěn)定性良好。

研究證實(shí)消癌平注射液及三大類組分能不同程度抑制人肺癌A549 細(xì)胞、人肝癌BEL-7402 細(xì)胞的增殖。本研究通過黏附［11］、遷移、侵襲［12-13］3個(gè)方面探索消癌平注射液及其大類組分不同配比組藥物(共計(jì)8 組藥物)可能的抗腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同藥物組對(duì)抗腫瘤轉(zhuǎn)移具有劑量與時(shí)間相關(guān)性，隨著劑量的增加，抑制率增大。綜上所述，8 組藥物中消癌平注射液組與3 種組分依據(jù)原固有比例配比組(2 號(hào)藥物)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無顯著性差異(P ＞0.05)，抑制作用相當(dāng)，抑制作用優(yōu)于兩種藥物配比組，更優(yōu)于單組分組。因此，我們根據(jù)中效原理［14-15］中的聯(lián)合作用公式設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)以研究三大類組分間是否存在協(xié)同作用，已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示消癌平注射液中的三大類組分中兩種組分聯(lián)合用藥時(shí)的合并指數(shù)CI 均小于1，初步說明消癌平注射液中的三大類組分在抗腫瘤作用方面具有協(xié)同作用。

本研究結(jié)果也體現(xiàn)了中藥多途徑、多靶點(diǎn)整合調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)。消癌平及大類組分不同配比組在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的細(xì)胞黏附、侵襲以及抗遷移均表現(xiàn)出抑制作用，其中抗侵襲作用的最高抑制率大于80%，推測抗侵襲作用是消癌平注射液發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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