肖穎梅，陳林妹，莫小林，夏星

（1.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西 南寧 530001 E－mail：54253210＠qq.com；2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，廣西 南寧 530023）

清解方為廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院的經驗方，全方由崗梅根、千里光、桑葉、一點紅組成，源于廣西壯鄉(xiāng)民間，由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒科李偉偉主任醫(yī)師挖掘整理而成，具有疏風清熱、解毒利咽的功效，在兒科臨床應用治療呼吸道炎癥性疾病十多年，療效確切。清解方制成湯劑口服在臨床上得到較好的療效，但是由于湯劑煎服不方便，藥味苦，兒童用藥不易接受。霧化吸入治療是利用射流原理，將水滴撞為微小霧滴懸浮于氣體中，形成氣霧劑輸入呼吸道內。目前國內中藥霧化吸入在臨床上應用廣泛，在肺部和呼吸道疾病方面展示出一定優(yōu)勢，在兒科霧化吸入治療呼吸道疾病也是常用的手段之一。目前廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院已經成功地對清解方湯劑進行劑型改造，開發(fā)了用于超聲霧化給藥的清解方霧化吸入劑，并且在呼吸系統(tǒng)疾病的治療中顯現(xiàn)了確切的療效［1］。清解方的霧化吸入劑尚無明確的功能學和安全性的實驗研究基礎，本研究小組采用現(xiàn)代藥理學的研究方法，科學地考察了清解方霧化吸入劑的急性毒性，并結合其吸入給藥的特征，考察了其對呼吸道黏膜的刺激性，為其臨床應用提供科學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重18～22g，動物批號：0006374；SD 大鼠18只，雌雄各半，體重220～260g，動物批號：0006365，均購買于廣西醫(yī)科大學動物實驗中心，實驗動物許可證號：SCKX 桂2009－0002。

1.2 藥品和試劑 清解方：清解方（20 倍濃縮液，由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科制備），制備方法為：將凈選后的崗梅根、千里光、桑葉、一點紅加水煎煮兩次，合并煎煮液，濃縮后加95%乙醇，過濾收集濾液，回收乙醇至藥液無醇味，加NaOH 調pH 至7，調整濃度后灌裝，高壓滅菌，臨床應用液每毫升中含有相當于0.544g的生藥材成分。氯化鈉注射液（由貴州天地藥業(yè)有限責任公司生產，批號：H13051603）。甲醛溶液（汕頭市西隴化工廠有限公司生產，批號：0710202），水合氯醛（成都市科尤化工試劑廠，批號：20120611）。

1.3 實驗儀器 WH－2000型超聲波霧化器（廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司），T500型電子天平（常熟雙杰測試儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 口服清解方的急性毒性考察 通過預實驗發(fā)現(xiàn)口服使用清解方能引起全部受試小鼠死亡，故采用改良寇氏法考察口服清解方對小鼠的半數(shù)致死量。正式實驗取昆明種小鼠60只，雌雄各半，隨機分成6組，10只／組，分別在1300～576.8g生藥／kg體重范圍內按照1∶0.85的比例設置供試樣品劑量，動物禁食12h后稱重，分別灌胃給予清解方，灌胃容量為40 ml／kg體重，灌胃后觀察記錄動物行為狀態(tài)的改變，連續(xù)觀察14d，記錄各組動物的死亡數(shù)量，對死亡動物進行尸檢，觀察重要臟器有無明顯病變。

2.2 霧化吸入清解方的安全性考察 通過預實驗發(fā)現(xiàn)高濃度的清解方霧化吸入，對小鼠沒有造成明顯的毒性作用，因此參考口服藥物的急性毒性方法，采用最大給藥量法（霧化吸入給藥）觀察清解方霧化吸入的安全性。取小鼠40只，雌雄各半，隨機分成兩組（空白對照組、清解方樣品組），禁食10h后稱重，分別霧化吸入清解方（4.35g／ml，20毫升／次），空白對照組采用同樣的方式霧化吸入蒸餾水，每次噴霧30 min，總計3次，兩次之間間隔6h。之后連續(xù)觀察14d。

2.3 清解方的黏膜刺激性考察 實驗方法參照《中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術指導原則》［2］。取SD 大鼠18只，隨機分為正常對照、清解方高劑量（5倍清解方）、低劑量（臨床濃度清解方）3組，每組6只。高、低劑量組大鼠雙側鼻孔以移液器定量滴入100μl相應藥物，同時雙側口腔以移液器定量滴入100μl相應藥物，正常組以100μl生理鹽水滴鼻和口腔，保證藥物與鼻腔接觸4h，給藥4h 后觀察60 min，記錄大鼠打噴嚏及撓鼻次數(shù)，并做t 檢驗。給藥后24h，水合氯醛麻醉大鼠，脫頸椎處死，剝離雙側口腔黏膜組織觀察充血、紅腫等表觀狀態(tài)，之后以4%甲醛溶液固定；并剝離鼻中隔同樣以4%甲醛溶液固定，石蠟包埋制作病理切片，觀察黏膜組織結構。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)均以（±s）表示，各組間差異采用t 檢驗，以P ＜0.05為組間差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 口服清解方的急性毒性實驗結果 各組小鼠灌胃后自發(fā)活動、梳理毛發(fā)活動明顯減少，動物多呈俯臥狀態(tài)，部分動物出現(xiàn)行動遲緩，進食量明顯減少。灌胃2～12h期間，各劑量組動物陸續(xù)出現(xiàn)死亡，576.8～1300g生藥／kg體重死亡數(shù)量與用藥劑量呈正相關。對死亡動物進行尸檢發(fā)現(xiàn)，大部分動物胃部飽脹，有腸脹氣和肝臟淤血。根據(jù)改良寇氏法計算得清解方的LD50為883.7g生藥／kg體重，95%置信區(qū)間為［1006.2，776.2］g生藥／kg體重。

3.2 霧化吸入清解方的安全性實驗結果 霧化吸入清解方后，與空白對照組比較，動物的行為、進食、四肢活動、呼吸、大小便及體重增長等情況未見異常。給藥14d后動物的體重增長結果見表1。清解方組動物體重增長與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。

表1 霧化吸入清解方后小鼠體重變化情況 （±s，n ＝10）

表1 霧化吸入清解方后小鼠體重變化情況 （±s，n ＝10）

組別 性別體重（g）藥前 藥后 實際增重增重率（%）空白對照組 ♂ 20.13±0.77 32.25±3.81 12.12 60.21♀ 19.92±0.94 26.27±3.48 6.35 31.88清解方組 ♂ 20.06±1.10 31.94±2.57 11.88 59.22♀ 19.90±0.84 26.93±2.88 7.03 35.33

3.3 清解方的黏膜刺激性實驗結果 鼻腔黏膜接觸清解方后，大鼠打噴嚏及撓鼻次數(shù)見表2。鼻腔滴入臨床應用劑量的清解方，大鼠打噴嚏及撓鼻次數(shù)均沒有明顯變化；而滴入5倍于臨床劑量清解方的大鼠打噴嚏顯著增加（t＝2.262，P ＝0.012＜0.05），撓鼻次數(shù)有增加的趨勢，但與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意 義（t＝2.262，P ＝0.092＞0.05）。

滴入清解方后，對口腔黏膜的直接觀察發(fā)現(xiàn)，應用兩個劑量的清解方對口腔黏膜的表觀狀態(tài)沒有明顯影響，未見大鼠口腔黏膜發(fā)紅、水腫或滲出。

鼻中隔及口腔黏膜的病理切片見圖1。口腔和鼻中隔黏膜未見充血和水腫，黏膜組織形態(tài)沒有明顯改變。

表2 清解方對大鼠鼻黏膜刺激結果 （±s，n ＝6）

表2 清解方對大鼠鼻黏膜刺激結果 （±s，n ＝6）

注：與正常組比較，a：P ＜0.05

組別 劑量（臨床劑量的倍數(shù)） 噴嚏次數(shù) 撓鼻次數(shù)正常組－0.7±1.2 1.0±2.0清解方高劑量組 5× 8.0±5.6a 5.4±8.0清解方低劑量組 1× 0.8±1.2 2.0±0.8

圖1 鼻中隔及口腔黏膜的HE染色圖，200×

鼻中隔及口腔黏膜厚度分析結果見表3 及表4。病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，口腔和鼻中隔黏膜未見充血和水腫的情況，臨床劑量的清解方對鼻黏膜及口腔黏膜的角質層、棘層厚度均沒有明顯影響。而5倍臨床劑量的清解方顯著增加了口腔黏膜棘層厚度（t＝1.998，P＝0.021＜0.05），并且輕度降低了鼻中隔黏膜厚度。

表3 清解方對大鼠鼻中隔黏膜厚度的影響 （±s，μm，n ＝6）

表3 清解方對大鼠鼻中隔黏膜厚度的影響 （±s，μm，n ＝6）

組別 劑量（臨床劑量的倍數(shù)） 角質層 棘層正常組－4.98±1.27 18.58±8.91清解方高劑量組 5× 4.67±1.28 16.61±7.34清解方低劑量組 1× 4.82±1.71 18.01±9.25

表4 清解方對大鼠口腔黏膜厚度的影響 （±s，μm，n ＝6）

表4 清解方對大鼠口腔黏膜厚度的影響 （±s，μm，n ＝6）

注：與正常組比較，a：P ＜0.05

組別 劑量（臨床劑量的倍數(shù)） 角質層 棘層正常組－39.69±23.67 112.93±38.68清解方高劑量組 5× 44.03±21.04 147.93±76.07a清解方低劑量組 1× 38.60±23.77 131.80±51.90

4 討論

清解方霧化吸入劑為在清解方湯劑的基礎上開發(fā)而來，經過臨床應用證明其霧化吸入在呼吸系統(tǒng)疾病中能獲得滿意的療效，但霧化吸入的清解方安全性和有效性尚沒有得到科學、規(guī)范的考察，為此本文開展了對清解方霧化吸入安全性的考察。由于超聲霧化儀的功率所限，高濃度的藥液無法有效霧化，因此霧化吸入毒性觀察實驗中霧化，藥物的最高應用濃度只能達到臨床濃度的5倍，通過1d內3次用藥，累計濃度達到臨床濃度的24倍，對小鼠仍然沒有明顯的毒性影響。而清解方霧化吸入劑在口服時仍有較強的急性毒性，但霧化吸入給藥時，藥物主要作用于呼吸道，真正吸收入血的藥物量遠小于口服吸收量，故清解方霧化吸入給藥不會引起類似于口服用藥的明顯毒性。

小鼠急性毒性的考察是對中藥安全性初步評價的常用方法，在許多研究中都有所應用［3－4］，能初步發(fā)現(xiàn)中藥的毒性嚴重程度，并可通過急性毒性實驗中動物的行為、表征的改變初步判斷藥物可能的毒性靶器官。清解方霧化吸入劑由崗梅根、千里光、桑葉、一點紅經水提醇沉制備而成，其中的千里光、一點紅都有一定的毒性。劉秋妍等［5］研究發(fā)現(xiàn)，千里光葉水提物的小鼠經口LD50為62.28g／kg；全草水提物LD50為81.65g／kg。并且祁乃喜等［6］通過分析給藥大鼠尿液中的內源性小分子代謝物的變化發(fā)現(xiàn)千里光吡咯里西啶類生物堿提取物能夠引起肝臟和腎臟損傷。而鐘正賢等［7］研究了一點紅的口服急性毒性，發(fā)現(xiàn)一點紅水提物的LD50為（9.22±0.027）g生藥／kg體重，且醇提取物的LD50為（3.15±0.026）g生藥／kg體重。由此可見，本研究中觀察到清解方霧化吸入劑口服后引起動物死亡的情況，可能與千里光、一點紅的毒性有直接關系。

在黏膜刺激性實驗中，臨床劑量及高濃度的清解方霧化吸入劑持續(xù)接觸黏膜4h 均不會引起明顯紅腫，并且臨床劑量對口、鼻黏膜組織形態(tài)也沒有顯著影響，提示當前使用的清解方霧化吸入劑不易引發(fā)黏膜刺激，進一步證實了該霧化吸入劑的安全性。但需要注意的是高濃度的清解方引起口腔黏膜棘層厚度顯著增加，表明在應用濃度過高的情況下該霧化吸入劑仍有引起黏膜刺激的可能性，應該避免高濃度用藥。

總之，清解方霧化吸入劑在動物實驗中有較為可靠的安全性，避免高劑量使用和大量誤服能進一步確保該霧化吸入劑的臨床安全使用。

［1］ 莫小林，李偉偉，申燕燕，等.壯藥清解霧化液的制備與治療天行赤眼的療效觀察［J］.廣西中醫(yī)藥，2012，35（1）：39－40.

［2］ 《中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術指導原則》課題研究組.中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術指導原則［Z］GPT4－1，2005：3.

［3］ 黃健，韋亞軍，韋慶寧，等.瑤藥紫九牛醇提物急性毒性及其對乙醇所致急性肝損傷的影響［J］.右江民族醫(yī)學院學報，2014，36（3）－325.

［4］ 李羨筠，梁少華.三氯異氰尿酸的急性毒性及刺激性試驗研究［J］.右江民族醫(yī)學院學報，2005，27（6）：781－783.

［5］ 劉秋妍，何麗霞，鄧向東，等.峨眉千里光對小鼠急性毒性及蓄積毒性研究［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2014（6）：55－57.

［6］ 祁乃喜，劉玉梅，何翠翠，等.中藥毒性的代謝組學研究（Ⅱ）：吡咯里西啶類生物堿的肝腎毒性［J］.南京中醫(yī)藥大學學報，2012，29（5）：448－451.

［7］ 鐘正賢，周桂芬，李燕婧.一點紅提取物藥理作用的實驗研究［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2006，27（4）：36－37.