何璇，韋維，陳文霞

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，廣西 南寧 530021 E－mail：hexuan269＠163.com）

組織工程化牙髓再生包括三個基本要素：種子細(xì)胞、生物支架和局部誘導(dǎo)微環(huán)境［1］。含有未分化間充質(zhì)干細(xì)胞的牙髓細(xì)胞來源相對廣泛、分離培養(yǎng)過程簡單，使其進(jìn)入牙髓再生種子細(xì)胞的選擇之列。富血小板纖維蛋白（platelet－rich fibrin，PRF）因其具有良好的三維結(jié)構(gòu)和生長因子釋放性能，目前已有研究者將其作為支架材料應(yīng)用于組織再生領(lǐng)域［2－3］。

本研究通過探索PRF 凝膠析出液對人牙髓細(xì)胞（human dental pulp cells，hDPCs）體外礦化的影響，評價PRF凝膠作為牙髓組織再生支架的生物學(xué)活性。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone，美國）；胎牛血清（Hyclone，美國）；胰蛋白酶（索萊寶，北京）；地塞米松（Sigma，美國）；β－甘油磷酸鈉（Sigma，美國）；維生素C（Sigma，美國）；5ml一次性使用真空采血管（精字，南昌）；PBS（邁新，福州）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；CO2孵育箱（Sheldon Manufacturing公司，美國）；倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus公司，日本）；臺式離心機(jī)（Sigma，美國）。

1.2 hDPCs的分離培養(yǎng) 經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會通過，經(jīng)患者知情同意。選取患者因治療需要拔除的健康恒牙，無菌高速渦輪機(jī)金剛砂車針沿牙釉質(zhì)－牙骨質(zhì)界進(jìn)行環(huán)形切割，暴露髓腔，取出牙髓后轉(zhuǎn)移至超凈臺。剪棄根尖1 mm 牙髓，在培養(yǎng)皿中將牙髓組織剪碎成約1mm×1mm×1mm 大小的組織塊若干。用滴管將組織塊轉(zhuǎn)移至25ml塑料培養(yǎng)瓶中，均勻平鋪于培養(yǎng)瓶底部，組織塊間距5～10 mm。加入1.5ml含20%FBS的DMEM 培養(yǎng)基。置飽和濕度、含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3d換液1次。待細(xì)胞生長達(dá)80%～90%融合時，胰蛋白酶消化傳代。

1.3 PRF凝膠析出液的制備 經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會通過，獲得志愿者的知情同意。抽取志愿者靜脈血5ml即刻置入真空采血管（不含任何抗凝劑），采用Choukroun一步離心法［4］，即400g離心10min，靜置5min制備PRF 凝膠，離心后血液分為3 層，上層為液態(tài)貧血小板血漿（platelet－poor plasma，PPP），下層為紅細(xì)胞，中間層即為PRF 凝膠。將真空采血管中的PRF 凝膠取出并稱重，每1.0g PRF凝膠置入2.5ml的DMEM 中，于第7d取析出液。

1.4 PRF 凝膠析出液對hDPCs體外礦化的影響 取第3代hDPCs，以1×104／孔的密度接種于6孔板，在常規(guī)培養(yǎng)基（含10%FBS、100U／ml青霉素和100 μg／ml鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基）中添加PRF 凝膠析出液孵育3d（析出液與培養(yǎng)基的比例為1∶1），以常規(guī)培養(yǎng)基作對照。在細(xì)胞貼壁生長達(dá)到80%融合時，更換含10 mmol／Lβ－甘油磷酸鈉、100μg／ml維生素C、10nmol／L地塞米松、20%FBS的DMEM 礦化誘導(dǎo)液，每3d換液1次。

1.5 茜素紅染色 礦化誘導(dǎo)21d時，從培養(yǎng)箱中取出6孔板，PBS浸泡清洗3次，40g／L 多聚甲醛固定15min，PBS沖洗3次，加入0.2% 茜素紅溶液，37 ℃染色30min，蒸餾水洗去多余染料，晾干，鏡檢。

1.6 RT－PCR 反應(yīng) 礦化誘導(dǎo)21d時，從培養(yǎng)箱中取出6孔板，用Trizol法提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以甘油醛－3－磷酸脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphate，GAPDH）做內(nèi)參，按試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時定量PCR 反應(yīng)，檢測ALP mRNA 表達(dá)水平，所用各引物序列見表1，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 人ALP引物序列

2 結(jié)果

2.1 組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)hDPCs 原代細(xì)胞培養(yǎng)時，貼壁的組織塊在體外培養(yǎng)5～7d開始向外爬出細(xì)胞，細(xì)胞呈典型的長梭形、成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，15d時可傳代。傳代后細(xì)胞呈放射狀集落生長，形態(tài)穩(wěn)定，平均約4d傳代1次，見圖1。

圖1 組織塊法培養(yǎng)牙髓細(xì)胞

2.2 茜素紅染色結(jié)果 礦化誘導(dǎo)21d后，茜素紅染色觀察到hDPCs由長梭形、成纖維細(xì)胞樣形態(tài)變成了鵝卵石狀并呈疊瓦狀排列，實(shí)驗(yàn)組有少量橘紅色的鈣結(jié)節(jié)生成，而對照組無鈣結(jié)節(jié)生成，見圖2。

圖2 hDPCs礦化誘導(dǎo)茜素紅染色結(jié)果

2.3 RT－PCR 結(jié)果 誘導(dǎo)礦化21d后，RT－PCR檢測ALP mRNA 表達(dá)水平顯示，經(jīng)PRF析出液孵育后的hDPCs的ALP表達(dá)水平是對照組的1.5倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見圖3。

圖3 PRF凝膠析出液對hDPCs的ALP mRNA 表達(dá)水平的影響

3 討論

牙髓細(xì)胞的成分包括成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、防御細(xì)胞和儲備細(xì)胞。成纖維細(xì)胞是牙髓的主體細(xì)胞，又稱為牙髓細(xì)胞。成纖維細(xì)胞可產(chǎn)生明膠狀基質(zhì)和膠原纖維，未成熟的成纖維細(xì)胞可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞［5］。本研究采用組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)牙髓細(xì)胞，所得到的細(xì)胞以長梭形的成纖維細(xì)胞為主。牙髓干細(xì)胞可從牙髓細(xì)胞中篩選分離獲得，然而干細(xì)胞移植需要復(fù)雜的分離過程及昂貴的細(xì)胞處理費(fèi)用，并存在一定的致瘤風(fēng)險(xiǎn)。因而本研究采用來源相對廣泛、分離培養(yǎng)過程簡單的牙髓細(xì)胞作為種子細(xì)胞。

PRF被譽(yù)為第二代血小板濃縮物［6］，其特有的三維結(jié)構(gòu)可以為組織再生提供支架，并且在降解的過程中可緩慢釋放多種生長因子促進(jìn)組織修復(fù)和再生［7］。本研究通過茜素紅染色和RT－PCR 評估PRF 凝膠析出液對hDPCs體外礦化的影響。茜素紅染色結(jié)果表明，礦化誘導(dǎo)21d后，經(jīng)PRF凝膠析出液孵育后的hDPCs可觀察到鈣結(jié)節(jié)生成，而未經(jīng)PRF 凝膠析出液孵育的hDPCs無鈣結(jié)節(jié)生成。ALP是參與骨等礦化組織形成、代謝和再生的一種功能性標(biāo)志酶［8］。牙乳頭外胚間充質(zhì)細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的過程中可分泌礦化前基質(zhì)，后者在ALP等礦化因子作用下才最終形成牙本質(zhì)。較高的ALP 是牙髓細(xì)胞分化的前提條件，其活性的增高是hDPCs早期成牙本質(zhì)／成骨向分化的標(biāo)志［9］。本研究RT－PCR 結(jié)果顯示，經(jīng)PRF析出液孵育后hDPCs的ALP mRNA 表達(dá)水平是對照組的1.5倍。

綜上所述，PRF凝膠析出液可促進(jìn)人牙髓細(xì)胞礦化，提示其具有成為牙髓再生的支架材料所必需的生物學(xué)活性。

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