李凱霞，劉福民

1.徐州醫(yī)學(xué)院研究生院，江蘇徐州 221004；2.淮安市婦幼保健院，江蘇淮安 223300

Toll受體4的表達(dá)與胎膜早破患者絨毛膜羊膜炎的關(guān)系探討

李凱霞1，劉福民2

1.徐州醫(yī)學(xué)院研究生院，江蘇徐州 221004；2.淮安市婦幼保健院，江蘇淮安 223300

目的探討分析Toll受體4（TLR4）的表達(dá)與胎膜早破患者絨毛膜羊膜炎的關(guān)系。方法隨機(jī)選取2013年1月—2015年4月胎膜早破病例30例（研究組）與正常晚期妊娠女性30例（對照組），分別測定胎盤組織TLR4定位、表達(dá)特點(diǎn)以及白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）水平，予以產(chǎn)后胎膜病理檢查。結(jié)果2組TLR4胎盤表達(dá)情況以及胎盤TLR4mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；研究組血清IL-8水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。最終檢查發(fā)現(xiàn)組織絨毛膜羊膜炎23例，TLR4表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），TLR4mRNA水平高于無組織絨毛膜羊膜炎者，組織絨毛膜羊膜炎者IL-6、IL-8水平高于無組織絨毛膜羊膜炎者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。該組胎膜組織病理檢查確認(rèn)為亞臨床型絨毛膜羊膜炎，三期急性炎性改變，Ⅰ期、Ⅱ、Ⅲ期改變逐漸明顯。結(jié)論TLR4上升以及IL-8上升均與絨毛膜羊膜炎有關(guān)聯(lián)，IL-8變化關(guān)系到胎膜完整性，對TLR4的監(jiān)測是防控胎膜早破、絨毛膜羊膜炎的關(guān)鍵。

Toll受體4；表達(dá)；胎膜早破；絨毛膜羊膜炎

胎膜早破主要因感染所致，Toll樣受體與固有免疫左右有直接關(guān)聯(lián)，而TLRs作用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等環(huán)節(jié)，TLR4關(guān)系到內(nèi)毒素信號傳導(dǎo)過程，且可能與胎膜早破絨毛膜羊膜炎的發(fā)生有關(guān)[1]，該研究隨機(jī)選取2013年1月—2015年4月胎膜早破病例30例為研究對象，探討分析了TLR4與胎膜早破絨毛膜羊膜炎之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2013年1月—2015年4月胎膜早破病例30例（研究組）與正常晚期妊娠女性 30例（對照組），研究組年齡22～34歲，平均年齡（26.8±2.4）歲；對照組年齡23～33歲，平均年齡（26.3±2.8）歲，其中15例孕周在28～37周之間（對照1組），另15例孕周≥37周（對照2組）。2組基礎(chǔ)資料對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

2組均在剖宮產(chǎn)之時剪取臍帶附著處胎盤垂直斷面中央標(biāo)本2塊，使用0.9%氯化鈉溶液將標(biāo)本漂洗干凈，其中1塊以液氮冷凍處理，置于-70℃環(huán)境中備用，另1塊用來提取RNA。

2組孕婦分娩前均常規(guī)抽取肘靜脈血標(biāo)本各5mL，高敏放射免疫測定標(biāo)本中IL-6、IL-8水平，產(chǎn)后均在破口部分剪取胎膜組織標(biāo)本，以10%甲醛固定送檢。

免疫組化。冰凍切片取出，厚度維持在10μm，并以冷丙酮固定處理、將內(nèi)源性過氧化物酶去除。山羊血清與0.1%Triton X-100溶液通透細(xì)胞封閉處理。將兔抗人TLR2 IgG抗體滴到切片之上，置于4℃濕盒內(nèi)一夜。取出后清洗，將生物素化山羊抗兔IgG/HRP二抗滴入，二氨基聯(lián)苯氨顯色處理，顯色后再以蘇木素染色，梯度乙醇處理后脫水，封片。觀察組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，若結(jié)構(gòu)依然完整，且發(fā)現(xiàn)棕褐色胞漿，胞核為藍(lán)色陽性；細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整但胞核為藍(lán)色，未見棕褐色胞漿，則胞核映襯下可見淺藍(lán)色，判定為陰性細(xì)胞。

檢測胎盤組織TLR 4的mRNA。組織標(biāo)本置于冰盒，Trizol液研磨處理，將胎盤組織總RNA以Trizol一步法提取出來，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，將TLR2、TLR4引物加入并誘導(dǎo)擴(kuò)增。分別在94℃環(huán)境下處理5min、30 s，72℃環(huán)境下處理30 s、54℃環(huán)境下處理30 s，72℃延伸處理7min，進(jìn)行PCR反應(yīng)。參照2%瓊脂糖快速電泳β-actin，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物分析。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照第8版謝幸主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》診斷胎膜早破[2]。胎膜組織病理檢查出現(xiàn)炎性反應(yīng)，產(chǎn)前階段或分娩后24 h后測量體溫在37.5℃之上，有高于標(biāo)準(zhǔn)值的白細(xì)胞計(jì)數(shù)，惡露有臭味；胎膜病理檢測為炎性，即診斷為絨毛膜羊膜炎[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 16.0軟件對該研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，對比應(yīng)用t檢驗(yàn)，P＜0.05時，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLR 4表達(dá)情況

2組TLR4胎盤表達(dá)情況以及胎盤TLR4 mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；研究組血清IL-6、IL-8水平明顯高于對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 TLR 4表達(dá)與絨毛膜羊膜炎關(guān)聯(lián)

最終檢查發(fā)現(xiàn)組織絨毛膜羊膜炎23例，TLR4表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），TLR4mRNA水平高于無組織絨毛膜羊膜炎者，組織絨毛膜羊膜炎者IL-6、IL-8水平高于無組織絨毛膜羊膜炎者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 胎盤組織TLR4、IL-8水平與絨毛膜羊膜炎關(guān)聯(lián)（x±s）

2.3 該組胎膜組織病理檢查

組胎膜組織病理檢查確認(rèn)為亞臨床型絨毛膜羊膜炎，均采用HE染色，圖1為Ⅰ期絨毛膜羊膜炎胎膜組織，圖2為Ⅱ期絨毛膜羊膜炎胎膜組織，圖3為Ⅲ期絨毛膜羊膜炎胎膜組織，三期絨毛膜羊膜炎胎膜組織均呈現(xiàn)出陽性反應(yīng)，且出現(xiàn)了急性炎性改變，Ⅰ期、Ⅱ、Ⅲ期改變逐漸明顯。

圖1 Ⅰ期絨毛膜羊膜炎胎膜組織

圖2 Ⅱ期絨毛膜羊膜炎胎膜組織

圖3 Ⅲ期絨毛膜羊膜炎胎膜組織

3 討論

生殖道病原微生物的上行性感染等因素會直接導(dǎo)致胎膜早破等現(xiàn)象的發(fā)生。國外學(xué)者提出，正常足月妊娠者胎盤免疫組化研究可見TLR2、TLR4正常表達(dá)，這是因?yàn)樯鲜鑫镔|(zhì)在分娩發(fā)動調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著一定的作用[4]，研究還發(fā)現(xiàn)，TLRs直接影響介導(dǎo)母體胎兒之間的天然免疫工作[5]。該研究為探討分析Toll受體4（TLR4）的表達(dá)與胎膜早破患者絨毛膜羊膜炎的關(guān)系，使用RTPCR技術(shù)以及免疫組化技術(shù)分別測定正常妊娠晚期以及胎膜早破孕婦胎盤組織TLR4mRNA表達(dá)情況以及蛋白表達(dá)特點(diǎn)，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2組TLR4胎盤表達(dá)情況以及胎盤TLR4mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；研究組血清IL-8水平明顯高于對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。最終檢查發(fā)現(xiàn)組織絨毛膜羊膜炎23例，TLR4表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），TLR4 mRNA水平高于無組織絨毛膜羊膜炎者，組織絨毛膜羊膜炎者IL-8水平高于無組織絨毛膜羊膜炎者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示TLR4在正常妊娠情況下以及胎膜早破情況下有相似的胎盤組織表達(dá)特征，胎膜早破確實(shí)不是因單一因素產(chǎn)生的。

國外學(xué)者相關(guān)研究結(jié)果提出，合并絨毛膜羊膜炎孕產(chǎn)婦體內(nèi)有高于正常情況的TLR2及TLR4表達(dá)現(xiàn)象，足月臨產(chǎn)、未臨產(chǎn)孕婦體內(nèi)TLR2、TLR4mRNA水平測定結(jié)果顯示，臨產(chǎn)孕婦相比未臨產(chǎn)孕婦更高[6]。該研究數(shù)據(jù)結(jié)果與已有主要文獻(xiàn)結(jié)果基本一致。TLR2、TLR4表達(dá)水平均高于正常范圍，此種現(xiàn)象并沒有與胎膜完整性密切的相關(guān)性，但受到絨毛膜羊膜炎發(fā)生的直接影響，證實(shí)了TLRs作為先天性免疫重要組成部分的事實(shí)，提示宿主防御機(jī)制在抵抗感染方面十分重要[7]。

IL-8即中性粒細(xì)胞激活肽，其中包含72個氨基酸，為C-X-C家族細(xì)胞因子之一，有明顯的中性粒細(xì)胞激活與趨化作用，還直接參與并影響白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞黏附過程，有長于IL-8的半衰期，為重要的免疫調(diào)節(jié)因子、炎性介質(zhì)，相比一般炎性介質(zhì)有更高的特異性以及敏感性[8]。一旦發(fā)生絨毛膜羊膜感染現(xiàn)象，胎盤就會在刺激下激活TLR4、釋放IL-8，胎膜早破并絨毛膜羊膜炎與胎盤組織中IL-8的分泌以及TLR4的表達(dá)均有關(guān)聯(lián)，但目前尚不明確TLR4的內(nèi)源性配體激活特征[9]。

該研究中，TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)方面可能不甚準(zhǔn)確，主要的影響因素包括TLR4的 mRNA及蛋白表達(dá)存在一些不同，mRNA相較蛋白合成半衰期更短，且mRNA是為絨毛膜、羊膜等細(xì)胞膜做準(zhǔn)備，而蛋白表達(dá)則僅僅在羊膜羊皮細(xì)胞上完成；mRNA以大量18sRNA基因合成產(chǎn)生，蛋白表達(dá)僅僅是著色的羊膜細(xì)胞部分表達(dá)產(chǎn)生[10]。

綜上所述，TLR4上升以及IL-8上升均與絨毛膜羊膜炎有關(guān)聯(lián)，IL-8變化關(guān)系到胎膜完整性，對TLR4的監(jiān)測是防控胎膜早破、絨毛膜羊膜炎的關(guān)鍵。TLR4在分娩調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。TLR4的表達(dá)不僅在分娩的生理過程中發(fā)揮影響，TLR4的胎膜組織表達(dá)上調(diào)也是組織絨毛膜羊膜炎這個病理過程的影響因素。該研究樣本量較小，數(shù)據(jù)不及和不準(zhǔn)確之處仍需進(jìn)一步大范圍、精細(xì)研究進(jìn)一步佐證，臨床上應(yīng)當(dāng)重視TLR4表達(dá)與妊娠分娩、宮內(nèi)感染先天免疫作用，在臨床診療中充分利用該項(xiàng)指標(biāo)的檢測分析與調(diào)控。

[1]薛會靈,劉金,梁玲，等.未足月胎膜早破產(chǎn)婦胎膜組織中TLR2表達(dá)變化及意義[J].山東醫(yī)藥,2014(18):8-9.

[2]薛會靈,劉金,梁義娟，等.未足月胎膜早破患者外周血單個核細(xì)胞TLR2mRNA水平變化及意義[J].山東醫(yī)藥,2014(24):32-33.

[3]曹耀輝.胎膜早破合并絨毛膜羊膜炎患者胎盤組織中TLR2的表達(dá)變化及意義[J].山東醫(yī)藥,2010(50):93-94.

[4]薛會靈,梁義娟,梁玲，等.胎膜中Toll樣受體2及受體4與胎膜早破的關(guān)系[J].國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志,2014(2):194-196.

[5]曹耀輝.Toll受體4的表達(dá)與胎膜早破患者絨毛膜羊膜炎的關(guān)系[J].河北醫(yī)藥,2011,33(4):565-566.

[6]曹耀輝.胎膜早破患者胎盤組織中TLR2和TLR4的表達(dá)及與絨毛膜羊膜炎的關(guān)系[J].河北醫(yī)藥,2011,33(2):218-219.

[7]劉婷,陳衡,何春容，等.聯(lián)合檢測胎膜早破合并感染孕婦外周血C-反應(yīng)蛋白及CD14+單核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)的變化[J].中國保健營養(yǎng)，2012(5中旬刊):55-56.

[8]谷惠芳,戎小平,張煥改，等.TLR-4、TNF-α、IL-6與早產(chǎn)的關(guān)系及意義[J].臨床兒科雜志,2014(11):1039-1041,1047.

[9] Kacerovsky,M.,Andrys,C.,Hornychova,H，et al.Amniotic fluid soluble Toll-like receptor 4 in pregnancies complicated by preterMprelabor rupture of the membranes[J].The journal of maternal-fetal& neonatalmedicine,2012,25(7):1148-1155.

[10]TiMG.A.M.Wolfs,Boris W.Kramer,Geertje Thuijls，et al.Chorioamnionitis-induced fetal gut injury ismediated by direct gut exposure of inflammatory mediators or by lung inflammation[J].American Journal of Physiology,2014,306(3):G382-G393.

Investigation of the Relationship Between the Expression of Toll Receptor 4 and PreMature Rupture of Membranesw ith Chorioamnionitis

LIKai-xia1，LIU Fu-min2
1.Graduate School,Xuzhou Medical College,Xuzhou,Jiangsu Province,221004 China;2.Huai'an Maternal and Child Health-care Center,Huai'an,Jiangsu Province,223300 China

ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of Toll receptor 4(TLR4)and premature rupture ofmembraneswith chorioamnionitis.Methods30 caseswith premature rupture ofmembranes(study group)and 30 normal pregnant women in late pregnancy(control group)were selected.All the subjects underwent themeasurementof the positioning andexpression characteristics of placenta TLR4,and the level of IL-6 and IL-8,and postpartuMfetalmembrane pathology examination.ResultsTherewas no statistically significant difference in the expression of placenta TLR4 and the level of TLR4 mRNA between the two groups(P＞0.05).The level of seruMIL-8 wasmuch higher in the study group than in the control group(P＜0.05).The final check found that 23 cases with chorioamnionitis,no statistically significant difference in the expression level of TLR4 was found between the groups(P＞0.05).Chorioamnionitis patients had higher TLR4 mRNA level than patientswithout chorioamnionitis.Chorioamnionitis patients had higher IL-6 and IL-8 level than patients without chorioamnionitis(P＜0.05).PostpartuMfetalmembrane pathology examination identified subclinical chorioamnionitiswith stageⅢacute inflammatory changes and stageⅠ,Ⅱ,Ⅲgradually significant changes.ConclusionThe rise of TLR4 and IL-8 levels is associated with chorioamnionitis;changes of IL-8 are associated with fetalmembrane integrity;themonitoring of TLR4 is the key to preventing and controlling the incidence of premature rupture ofmembranes and chorioamnionitis.

Toll receptor 4;Expression;Premature rupture ofmembranes;Chorioamnionitis

R4.433

A

1674-0742（2015）07（a）-0001-03

2015-04-02）

表1 2組受試者胎盤組織TLR4、IL-6、IL-8水平[ng/L，（x±s）]

組別TLR4（陽性細(xì)胞數(shù)/mm2）TLR4 mRNA血清IL-6（ng/L）血清IL-8（ng/L）研究組（n=30）對照組（n=30）tP 10.4±2.4 9.1±1.1 0.248 0.892 0.842±0.005 0.702±0.012 1.009 0.482 0.048±0.16 0.027±0.09 14.558 0.005 0.098±0.24 0.58±0.12 19.528 0.002

李凱霞（1977.7-），女，江蘇淮陽人，本科，主治醫(yī)師，研究方向：婦產(chǎn)科。

劉福民（1958.10-），男，山東郯城人，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：婦產(chǎn)科。