曾云勝 張玲莉 彭 燕

1.湖北省仙桃市第一人民醫(yī)院藥劑科袁湖北仙桃433000曰2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部袁湖北武漢430060

顯色基質(zhì)法檢測乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素

曾云勝1張玲莉2彭 燕2

1.湖北省仙桃市第一人民醫(yī)院藥劑科袁湖北仙桃433000曰2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部袁湖北武漢430060

目的比較顯色基質(zhì)法與凝膠法檢測乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素的效果。方法采用樣品稀釋法研究顯色基質(zhì)鱟試劑對不同批號乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的干擾袁并與凝膠法鱟試劑對樣品的干擾試驗(yàn)比較。結(jié)果顯色基質(zhì)法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)逸0.98袁乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液在0.5 mg/mL濃度時(shí)無干擾作用袁明顯高于凝膠法無干擾濃度(0.125 mg/mL)。結(jié)論與凝膠法比較袁顯色基質(zhì)法有靈敏堯快速堯能定量堯重復(fù)性好的特點(diǎn)袁可用于乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液內(nèi)毒素含量的測定。

顯色基質(zhì)鱟試劑法；凝膠法；細(xì)菌內(nèi)毒素；干擾試驗(yàn)；乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液

注射用乳酸環(huán)丙沙星具有廣譜抗菌作用袁是較早應(yīng)用于臨床的喹諾酮類藥物袁尤其對需氧革蘭陰性桿菌引起的感染有效袁由于其價(jià)格低廉袁療效明確袁因此在臨床上被廣泛應(yīng)用。2010年版葉中國藥典曳規(guī)定乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液熱原檢測采用家兔法[1]袁國家藥典委員會于2012年8月3日已經(jīng)公布的葉關(guān)于注射用乳酸環(huán)丙沙星的國家標(biāo)準(zhǔn)草案的公示曳袁其中規(guī)定了野細(xì)菌內(nèi)毒素檢查冶袁用0.06 EU/mL或更高靈敏度的鱟試劑凝膠法檢查(葉中國藥典曳2010版二部附錄欲E[1])袁每毫克環(huán)丙沙星中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.50 EU。在凝膠法檢查基礎(chǔ)上袁筆者依顯色基質(zhì)法規(guī)定袁通過試驗(yàn)進(jìn)行乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液中顯色基質(zhì)法檢查的方法學(xué)研究袁以期為環(huán)丙沙星檢測內(nèi)毒素尋求較為合適的方法。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是檢測供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量的方法袁主要方法分為凝膠法和光度測定法袁后者包含濁度法和顯色基質(zhì)法。法定標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定越來越多的注射制劑采用此法控制藥品中熱原的含量。近年來袁藥典委員會要求各地藥檢部門做了很多工作袁研究細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法的合理性和可靠性。筆者對乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測進(jìn)行方法學(xué)研究袁建立了顯色基質(zhì)法檢測該藥中細(xì)菌內(nèi)毒素方法袁相比凝膠法袁更快速準(zhǔn)確。

1 儀器與試劑

1.1 顯色基質(zhì)鱟試劑盒

顯色基質(zhì)鱟試劑(批號院120603)1.7 m L袁顯色基質(zhì)(批號院120605)1.7mL袁偶氮化試劑一(批號院120628) 10 mL袁偶氮化試劑二(批號院120629)10 mL袁偶氮化試劑三(批號院120630)10mL袁HCl反應(yīng)終止劑(批號院120623)50 mL。由廈門市鱟試劑試驗(yàn)廠有限公司生產(chǎn)。

1.2 凝膠法鱟試劑

鱟試劑(靈敏度0.25 EU/mL袁廈門市鱟試劑試驗(yàn)廠有限公司袁批號院130917)曰鱟試劑(靈敏度0.03EU/mL袁廈門市鱟試劑試驗(yàn)廠有限公司袁批號院030511)曰鱟試劑(靈敏度0.03 EU/mL袁湛江安度斯生物有限公司袁批號院1301161)。

1.3 其他試劑

細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)(100 EU/支袁中國藥品生物制品檢定所袁批號院150608-201298)曰細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水(BET水)(廈門市鱟試劑試驗(yàn)廠有限公司袁批號院130428)50 mL。

1.4 樣品

乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液(商品名院西普樂袁拜耳制藥有限公司袁100 mL頤0.2 g頤0.9 g)3批(批號院BXGG4D7堯BXGG4F1堯BXGG4C6)。

1.5 其他材料

紫外可見分光光度計(jì)UV-2450(日本島津儀器公司)袁除熱原吸頭(200堯1000滋L)袁玻璃比色杯(0.5 cm)袁渦旋混合儀Vortex-Genie 2(美國Scientific Indus鄄tries)袁電熱恒溫水浴鍋TZL-5003(蘇州珀西瓦爾試驗(yàn)設(shè)備有限公司)袁定量可調(diào)移液器(上海求精玻璃儀器廠袁100耀1000滋L袁20耀200滋L)盛冰水托盤袁試管架。

2 方法與結(jié)果

2.1 確定供試品內(nèi)毒素限值

細(xì)菌內(nèi)毒素限值L=K/M袁其中K表示人每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量袁藥典規(guī)定一般注射劑為5 EU/(kg窯h)袁M表示人每千克體質(zhì)量每小時(shí)的最大供試品劑量[1]。乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液說明書規(guī)定成人1 h靜注最大劑量600mg袁人均體質(zhì)量按60 kg估算袁則M=10 mg/(kg窯h)。計(jì)算得出本品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L=0.5 EU/mg袁環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的濃度為2mg/mL袁限值即為L=1 EU/mL。

2.2 可靠性試驗(yàn)

顯色基質(zhì)法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制院取細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)1支袁加入1 m L BET水復(fù)溶袁旋渦震蕩混合15 min袁即得100 EU/mL細(xì)菌內(nèi)毒素溶液袁然后取0.1mL細(xì)菌內(nèi)毒素溶液袁加入BET水0.9mL袁渦旋震蕩30 s袁稀釋為10 EU/mL袁再繼續(xù)用BET水將其稀釋至1 EU/mL細(xì)菌內(nèi)毒素母液袁備用。取相應(yīng)量鱟試劑堯顯色基質(zhì)堯偶氮化試劑二堯偶氮化試劑三分別用BET水溶解袁偶氮化試劑一用HCl反應(yīng)終止劑溶解袁震蕩10 s袁備用。取2mL空安瓿15支袁分別加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(1.0堯0.8堯0.6堯0.4堯0.2mL)和1 EU/mL的細(xì)菌內(nèi)毒素母液(0堯0.2堯0.4堯0.6堯0.8 mL)制成系列細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(分別含有細(xì)菌內(nèi)毒素0堯0.2堯0.4堯0.6堯0.8 EU/mL)。取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL分別加入反應(yīng)試管中(冰浴袁預(yù)先加有0.1mL鱟試劑的除熱原玻璃試管10 mm伊75 mm)袁震蕩10 s后袁置于37益水浴箱中孵育10 min袁取出試管曰加入顯色基質(zhì)0.1 mL(冰浴)袁再置入37益水浴箱孵育6 min袁取出試管曰迅速加入偶氮試劑一(冰浴)堯偶氮試劑二堯偶氮試劑三各0.5 mL。靜置5min后袁檢測樣品反應(yīng)液在545 nm處的吸光度袁用空白對照管校正。平均吸光度測定值依次為0.03堯0.153堯0.311堯0.456堯0.641。平均吸光度對內(nèi)毒素濃度作線性回歸袁得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.7256X+0.1878 (r=0.9972)袁r逸0.98袁試驗(yàn)有效。

2.3 顯色基質(zhì)法的樣品干擾試驗(yàn)

將批號為BXGG4D7堯BXGG4F1堯BXGG4C6的乳酸環(huán)丙沙星注射液樣品袁即濃度為2.0 mg/mL的樣品溶液袁成倍稀釋4個(gè)稀釋級(1頤2堯1頤4堯1頤8堯1頤16樣品稀釋液袁即濃度為1.0堯0.5堯0.25堯0.125mg/mL的樣品溶液袁稱為NPC溶液)袁分別用4個(gè)不同稀釋級供試品溶液加入1 EU/mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液袁配制濃度為0.5 EU/mL內(nèi)毒素樣品系列溶液(稱為PPC溶液)曰分別測量不同濃度PPC系列和NPC系列樣品在545 nm處的吸光度袁然后依據(jù)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中內(nèi)毒素濃度。加入內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的供試品溶液內(nèi)毒素濃度(Cs)和未加內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的供試品溶液內(nèi)毒素濃度(Ct)袁通過公式計(jì)算不同稀釋倍數(shù)溶液的內(nèi)毒素回收率(R)院R=(Cs原Ct)/0.5伊100%。表1結(jié)果顯示袁樣品稀釋至1頤4堯1頤8堯1頤16倍后對鱟試劑顯色沒有干擾作用袁細(xì)菌內(nèi)毒素回收率都在50%耀100%。樣品原液和1頤2倍樣品稀釋溶液有一定抑制干擾作用袁細(xì)菌內(nèi)毒素顯色作用被抑制袁回收率不足50%袁表明樣品稀釋至0.5 mg/mL可以消除樣品對顯色鱟試劑的干擾。

2.4 凝膠法的樣品干擾試驗(yàn)

2.4.1 干擾試驗(yàn)相關(guān)樣品濃度的計(jì)算凝膠法鱟試劑的靈敏度一般在0.03耀0.50 EU/mL袁在確定乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為1 EU/mL后袁可求得樣品的最小非干擾質(zhì)量濃度不能低于原液17倍稀釋濃度袁即0.117 mg/mL。

2.4.2 乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液干擾預(yù)試驗(yàn)取靈敏度姿為0.25 EU/mL的鱟試劑做預(yù)試驗(yàn)袁將供試品(批號院BXGG4D7)分別稀釋至1.0堯0.5堯0.25堯0.125堯0.0625 mg/mL后進(jìn)行干擾試驗(yàn)袁同時(shí)配制兩份一系列同樣濃度的樣品溶液袁分別在其中加入內(nèi)毒素袁使每一濃度的樣品溶液中含有2姿(0.5 EU/mL)和0.25姿(0.0625 EU/mL)的細(xì)菌內(nèi)毒素袁此系列溶液被稱為供試品陽性對照液袁試驗(yàn)取細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分別做陽性對照液堯陰性對照液袁每個(gè)樣品平行操作2管。表2可見乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液(在0.125 mg/mL或更低質(zhì)量濃度時(shí))不會抑制干擾鱟試劑凝集。

表1 顯色基質(zhì)法的樣品細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)結(jié)果

表2 凝膠法乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 供試品的干擾試驗(yàn)分別取廈門鱟試劑試驗(yàn)廠有限公司和湛江安度斯生物有限公司兩個(gè)不同廠家生產(chǎn)的靈敏度為0.03 EU/mL(批號分別為1301161堯130511)的鱟試劑袁對3批(BXGG4D7堯BXGG4F1堯BXGG4C6)0.125mg/mL的乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾試驗(yàn)袁計(jì)算細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液稀釋樣測定的反應(yīng)終點(diǎn)濃度幾何平均值Es和Et袁當(dāng)Et在0.5耀2.0時(shí)袁認(rèn)為乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液在該濃度下不干擾鱟試劑試驗(yàn)袁每管平行操作4份袁陰性對照設(shè)2個(gè)平行管。表3顯示袁乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液在稀釋至0.125mg/mL時(shí)袁其測定Et與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水的Es相比均在0.5耀2.0袁且Es與鱟試劑靈敏度(0.5耀2.0)姿一致袁樣品稀釋液對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用。

表3 凝膠法供試品的干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品的測定

2.5.1 顯色基質(zhì)法樣品測定選擇樣品(原濃度2.0mg/mL)加入BET水袁制得稀釋液1頤4(稀釋后濃度0.5mg/mL)作為供試品溶液檢查各批樣品內(nèi)毒素含量。取供試品0.1 mL按野2.2冶項(xiàng)操作袁測定供試品內(nèi)毒素含量袁結(jié)果BXGG4D7堯BXGG4F1堯BXGG4C6三批樣品定量檢測結(jié)果表明內(nèi)毒素含量均小于0.01 EU/mL袁符合規(guī)定限度1 EU/mL以下。

2.5.2 凝膠法樣品測定取乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液稀釋至0.125mg/mL作為供試品溶液袁用靈敏度姿= 0.03 EU/mL凝膠鱟試劑檢查袁結(jié)果BXGG4D7堯BXGG4F1堯BXGG4C6三批樣品結(jié)果均呈陰性袁即小于1 EU/mL袁符合規(guī)定。

3 討論

顯色基質(zhì)法相對凝膠法有抗干擾能力增強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。文獻(xiàn)表明[2]袁凝膠法稀釋倍數(shù)為16倍袁略低于最大稀釋倍數(shù)17倍曰在檢測時(shí)鱟試劑只能選取最小靈敏度(0.03 EU/mL)進(jìn)行試驗(yàn)袁增加試驗(yàn)耗材成本曰最大不干擾試驗(yàn)濃度0.125 mg/mL袁略大于最小稀釋樣品濃度0.117 mg/m L袁因此檢測時(shí)袁稀釋過程較多袁容易引入試驗(yàn)誤差曰終點(diǎn)顯色基質(zhì)法與凝膠法相比袁不僅抗干擾濃度提高至0.5 mg/m L袁具有較好的抗干擾能力袁減少試驗(yàn)操作多次稀釋帶來的誤差袁而且能定量測定樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量袁因此該試驗(yàn)方法更準(zhǔn)確堯科學(xué)。選用顯色基質(zhì)定量鱟試劑方法測定乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液具有優(yōu)勢。

顯色基質(zhì)法相對其他定量方法的優(yōu)點(diǎn)是試驗(yàn)條件相對低廉袁易于開展。根據(jù)2010年版葉中國藥典曳附錄[1]袁細(xì)菌內(nèi)毒素含量定量方法有多種[3-10]袁與其他細(xì)菌內(nèi)毒素含量測定方法相比袁終點(diǎn)顯色基質(zhì)法的檢測方法是在供試品和鱟試劑及顯色基質(zhì)之間的顯色反應(yīng)被HCl終止后袁通過可見分光光度計(jì)檢測反應(yīng)溶液在特定波長處吸光度來定量袁試驗(yàn)設(shè)備條件要求不高袁并且具有很好的重復(fù)性和可操作性。

干擾試驗(yàn)的常用方法和結(jié)果袁顯色基質(zhì)法考察的關(guān)鍵因素是樣品的干擾試驗(yàn)[11-14]。用供試品溶液配制樣品陽性溶液袁只有在樣品干擾試驗(yàn)中袁細(xì)菌內(nèi)毒素檢測回收率達(dá)到要求范圍袁試驗(yàn)結(jié)果方為有效。排除樣品溶液對鱟試劑的干擾方法包含樣品稀釋法和其他一些適宜的方法袁如色氨酸難溶于水袁需要加熱至80益袁再稀釋后才能檢測內(nèi)毒素袁而門冬氨酸和谷氨酸不僅需要稀釋袁還需要加入NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0后才能消除對試驗(yàn)的干擾[15]。干擾試驗(yàn)證明袁采用0.5mg/mL乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液稀釋液作內(nèi)毒素含量檢查溶液袁回收率符合要求。

顯色基質(zhì)法比凝膠法有定量和抗干擾強(qiáng)的優(yōu)勢袁但目前顯色基質(zhì)法并沒有得到較好的推廣應(yīng)用袁主要有兩個(gè)方面因素院淤顯色基質(zhì)鱟試劑試驗(yàn)操作過程略顯繁瑣[16]袁不僅鱟試劑反應(yīng)后孵育袁而且增加顯色基質(zhì)加入樣品孵育過程袁最后另加入偶氮試劑顯色袁比較耗費(fèi)試驗(yàn)時(shí)間曰于定量鱟試劑價(jià)格相比凝膠法沒有競爭力袁以檢測15個(gè)樣品為例袁凝膠法平均每單個(gè)樣本需要耗材約為定量顯色鱟試劑的一半。相信隨著顯色基質(zhì)鱟試劑生產(chǎn)工藝的改進(jìn)袁其成本會進(jìn)一步降低袁將被廣泛應(yīng)用。

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Bacterial endotoxin test of Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloride Injection by chromogenic substrate limulus amebocytelysate

ZENG Yunsheng1ZHANG Lingli2PENG Yan2
1.Department of Pharmacy,the First People憶s Hospital of Xiantao City,Hubei Province,Xiantao 433000,China; 2.Department of Pharmacy,People憶s Hospital ofWuhan University,Hubei Province,Wuhan 430060,China

Ob jective To compare bacterial endotoxin test of Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloride Injection by chromogenic substrate limulus amebocytelysatemethod and sol-gelmethod.M ethods Sample dilutionmethod was used to study of chromogenic substrate limulus reagent on different batches of Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloride Injection,compared with interfering test of sol-gel limulus reagent sample.Results The standard curve correlation co鄄efficient of chromogenic substrate limulus amebocytelysate was above 0.98.Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloride Injection was not interferewith the concentration of 0.5mg/mL,which was obviously higher than that ofgel coltmethod (0.125 mg/mL).Conclusion Compared with sol-gelmethod,chromogenic substratemethod has the characteristic of sen鄄sitive,rapid,quantitative and good repeatability,can be used for content determination on endotoxin of Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloride Injection.

Chromogenic substrate limulus amebocytelysate method;Sol-gelmethod;Bacterial endotoxin;Interfering test;Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloricle Injection

R965

A[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]1673-7210（2015）06（c）-0092-04

院2014-02-09本文編輯院李亞聰)

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013CFB239)。

曾云勝(1968.10-)袁男袁湖北仙桃人曰研究方向院醫(yī)院藥學(xué)曰主要成果院仙桃市科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)一項(xiàng)。

彭燕(1976.3-)袁女袁湖北人袁碩士曰研究方向院臨床藥學(xué)和醫(yī)院藥學(xué)曰主要成果院湖北省科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)兩項(xiàng)袁湖北省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)一項(xiàng)袁武漢市科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)一項(xiàng)袁武漢市科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)一項(xiàng)。