陳 婕，王肖龍

·綜述與進(jìn)展·

DNA甲基化對動脈粥樣硬化影響的研究進(jìn)展

陳 婕，王肖龍

動脈粥樣硬化性心血管病已成為全球人口主要致死的病因，其發(fā)病原因復(fù)雜。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要構(gòu)成之一，在甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性。近期研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。本文就DNA甲基化影響動脈粥樣硬化形成的近年來研究作一綜述。

動脈粥樣硬化；DNA甲基化；環(huán)境因素；基因

動脈粥樣硬化性心血管疾病已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國家的主要發(fā)病和死亡原因，發(fā)展中國家的發(fā)病率也在逐年增加[1]。2006年衛(wèi)生部就關(guān)于我國居民主要死亡原因情況進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)顯示：我國有1/3的疾病死亡歸為心血管疾病，之所以會成為全世界流行的疾病主要?dú)w因于環(huán)境因素和現(xiàn)代人的生活飲食習(xí)慣[2]。

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)主要的病理改變是動脈管壁內(nèi)脂質(zhì)積聚導(dǎo)致管壁增厚、彈性降低以及管腔狹窄。近年來國內(nèi)外學(xué)者對AS發(fā)病機(jī)制與表觀遺傳學(xué)的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。自1865年孟德爾發(fā)現(xiàn)分離規(guī)律和自由組合規(guī)律兩個重要的遺傳學(xué)規(guī)律以來，研究者們逐漸了解到不能僅僅從DNA序列上尋找眾多復(fù)雜疾病的病因。表觀遺傳學(xué)證實(shí)了組織細(xì)胞內(nèi)DNA序列并未改變但基因的表達(dá)水平可遺傳性變化。所以，基因組序列并不能完全解釋多因素疾病，基因-環(huán)境交互作用可能在動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展中起到關(guān)鍵的影響[3，4]。DNA甲基化是可以調(diào)控基因選擇性轉(zhuǎn)錄表達(dá)的表觀遺傳修飾，現(xiàn)已成為一個研究熱點(diǎn)。隨著國內(nèi)外學(xué)者大量的實(shí)驗(yàn)研究，DNA甲基化在AS的發(fā)病機(jī)制中也逐步被認(rèn)識?，F(xiàn)根據(jù)近年來關(guān)于DNA甲基化修飾作用于AS形成的研究結(jié)果進(jìn)行綜述。

1 DNA甲基化修飾

DNA甲基化為最多見的堿基化學(xué)修飾，在正常的細(xì)胞組織中，大部分散在的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)處于甲基化狀態(tài)，但CpG島則未被甲基化修飾，當(dāng)維持甲基化模式的酶出現(xiàn)調(diào)節(jié)紊亂時，被保護(hù)的CpG島區(qū)域內(nèi)的2-羰基-4-氨基嘧啶就會通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methytransferase，DNMT)甲基化后形成5-甲基胞嘧啶，使DNA構(gòu)象發(fā)生變化而不能啟動轉(zhuǎn)錄，阻礙基因表達(dá)。有實(shí)驗(yàn)證明如果DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methytransferase 1，DNMT1) 和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b(DNA methytransferase 3b，DNMT3b)共同作用會比三種甲基轉(zhuǎn)移酶單獨(dú)作用于甲基化位點(diǎn)更降低基因的表達(dá)水平。甲基化影響DNA轉(zhuǎn)錄的途徑可能有以下3條：①直接對易甲基化的轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生作用，使其失去與DNA相結(jié)合的能力；②甲基CpG黏附分子與甲基化不敏感的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而使它們活性喪失；③通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)阻礙轉(zhuǎn)錄因子與其調(diào)控序列結(jié)合。有研究者發(fā)現(xiàn)：DNMT、組蛋白修飾、RNA干擾均是DNA甲基化的影響因素。

2 DNA甲基化、同型半胱氨酸異常增高與動脈粥樣硬化形成

2.1 甲基化作用于動脈粥樣硬化形成 動脈粥樣硬化的形成受到基因組甲基化的影響，DNA甲基化可以調(diào)節(jié)某些被甲基化區(qū)域的基因表達(dá)和血管平滑肌細(xì)胞的分化[5]。Post等發(fā)現(xiàn)，與正常樣本相比，動脈粥樣硬化的斑塊中ER a啟動子CpG島甲基化水平增高，可能導(dǎo)致疾病基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化而使血管平滑肌細(xì)胞數(shù)目異常增多[6]。同時，我國有學(xué)者指出，動脈粥樣硬化的形成與高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)使單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)DNA低甲基化有關(guān)[7]。所以，AS的形成是多個基因甲基化以及不同基因不同甲基化水平聯(lián)合作用的結(jié)果。

2.2 高同型半胱氨酸調(diào)節(jié)甲基化修飾促進(jìn)動脈粥樣硬化形成 1969年McCully指出：血清中游離的同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)含量增高可能會促進(jìn)AS的發(fā)生。隨著表觀遺傳學(xué)近幾年來深入的研究，高同型半胱氨酸血癥對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的表觀遺傳學(xué)調(diào)控也逐漸被國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。Sharma等[4]將高同型半胱氨酸血癥的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic disease，CAD)患者與正常同型半胱氨酸的CAD患者對比，發(fā)現(xiàn)只有高同型半胱氨酸血癥的CAD患者DNA甲基化。同時，大量研究表明，同型半胱氨酸促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞數(shù)目過度增加，并且隨著Hcy濃度越高，作用時間越長，血管平滑肌細(xì)胞增殖程度越高[8，9]。血管平滑肌細(xì)胞數(shù)目異常增多后在脂肪條紋中泡沫化，促使脂肪條紋發(fā)生脂肪病變，形成纖維斑塊，最終發(fā)展成為動脈粥樣硬化[9]。但目前的發(fā)現(xiàn)尚不能解釋同型半胱氨酸水平如何調(diào)節(jié)AS的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。

3 關(guān)聯(lián)基因的甲基化和動脈粥樣硬化的關(guān)系

對AS相關(guān)基因甲基化的研究已成為當(dāng)今熱門趨勢，迄今為止，主要是關(guān)于雌激素受體基因、成纖維細(xì)胞生長因子、腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1的研究。

3.1 雌激素受體基因 雌激素受體基因是目前學(xué)者探究最多的基因。雌激素影響心肌重塑，防止細(xì)胞凋亡，避免心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和壞死。在正常機(jī)體中，雌激素可以拮抗動脈粥樣硬化性疾病，其關(guān)鍵是與雌激素結(jié)合的雌激素受體(estrogen receptor，ER)。雌激素受體有ERа、ERβ兩種亞型，存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。曾經(jīng)對于心血管的研究大部分都集中于ERа，直到1996年才對ERβ有所認(rèn)識。曾有報(bào)道顯示1/3 的ERа位于小窩蛋白-1中或者靠近腦動脈和冠狀動脈的血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)，而ERβ主要位于細(xì)胞核中。然而也有研究人員發(fā)現(xiàn)ERа和ERβ均存在于質(zhì)膜中，并且根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)了解到幾乎所有的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的活化均由ERβ介導(dǎo)[10，11]。

目前有研究表明，AS患者的外周血中ERа基因啟動序列CpG島甲基化呈陽性的比率高于對照組，并且實(shí)驗(yàn)組ERа基因的mRNA表達(dá)水平低于對照組，由此表明在AS患者病變過程中ERа基因的高甲基化狀態(tài)所致其RNA低水平表達(dá)可促進(jìn)AS的發(fā)生[12，13]。Kim等[14]通過對多部位動脈中粥樣斑塊區(qū)域和非粥樣斑塊區(qū)域?qū)Ρ鹊贸觯喊邏K區(qū)域中的ERβ始終呈較高的甲基化水平，當(dāng)抑制DNMT活性時ERβ會在血管細(xì)胞中活躍的表達(dá)。提示，ERβ基因的后生修飾異常會促進(jìn)AS的發(fā)展和血管老化。所以ERа和ERβ的DNA甲基化對AS的形成和發(fā)展均至關(guān)重要。

3.2 成纖維細(xì)胞生長因子 Tang等發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)在心血管系統(tǒng)中扮演著雙重角色。在正常的心臟血管壁中能維持血管的平衡穩(wěn)定，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活。但在動脈粥樣硬化病變的心臟血管中，F(xiàn)GF2及其受體參與炎癥反應(yīng)，使血管內(nèi)膜增生，促進(jìn)血管內(nèi)斑塊的形成[15]。Chang等[16]研究表示Hcy破壞內(nèi)皮細(xì)胞主要是通過轉(zhuǎn)錄抑制FGF2基因的啟動子，使其啟動子區(qū)甲基化，而特異性下調(diào)成纖維細(xì)胞生長因子在動脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。這一研究結(jié)果與Li等的結(jié)果相吻合。同時，Chang等[16]還發(fā)現(xiàn)如果抑制FGF2啟動子區(qū)甲基化，則上述改變可以發(fā)生逆轉(zhuǎn)。但目前國內(nèi)外關(guān)于FGF2甲基化促進(jìn)動脈粥樣硬化生成發(fā)展的機(jī)制的研究并不多，這或許是未來研究的一個新方向。

3.3 腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1 近幾年對腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding transporter A1，ABCA1) 研究成為國內(nèi)外的熱點(diǎn)。ABCA1包含兩個三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和兩個6-螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域，在某些組織中的外周血巨噬細(xì)胞中大量表達(dá)。ABCA1是膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)體，最主要的功能就是將血管壁上累積的膽固醇轉(zhuǎn)移到肝組織進(jìn)行排泄。同時，ABCA1也是高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)合成的關(guān)鍵基因，調(diào)節(jié)它的產(chǎn)生和遷移[17]。

我國學(xué)者實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[18，19]，AS患者白細(xì)胞中的ABCA1基因啟動子序列較正常人呈高甲基化狀態(tài)，ABCA1 基因的轉(zhuǎn)錄活性較正常人低，且隨著血漿中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平的增高而降低，表明白細(xì)胞中ABCA1 基因高甲基化和低HDL濃度與AS的形成有緊密的聯(lián)系。Yu等[17]做了關(guān)于同型半胱氨酸通過單核細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的ABCA1和酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1(acylcoenzyme A：cholesterol acyltransferase-1，ACAT1) DNA甲基化調(diào)節(jié)膽固醇排泄的研究發(fā)現(xiàn)，ABCA1 DNA甲基化抑制了ABCA1的表達(dá)而造成機(jī)體內(nèi)膽固醇大量累積。

3.4 與動脈粥樣硬化有關(guān)的其他基因 除了以上3種常見基因外，國內(nèi)外研究較多與AS形成發(fā)展有關(guān)的基因包括P53基因、細(xì)胞外超氧化物歧化酶基因等，而組織因子途徑抑制物2 (tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI -2)、低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein， LDL Receptor)基因和單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(monocarboxylate transporters，MCTs)等也尚有研究報(bào)道，而這些基因(見圖1)的甲基化或者多個基因表達(dá)水平改變的協(xié)同作用可能都會導(dǎo)致AS的形成。

注：EcSOD—細(xì)胞外超氧化物歧化酶；MCTs—單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；TFPI-2—組織因子途徑抑制物2。

圖1 與動脈粥樣硬化相關(guān)的基因甲基化

4 外界環(huán)境因素、生活飲食習(xí)慣對甲基化修飾的影響

研究顯示環(huán)境因素和生活飲食習(xí)慣很大程度地影響了動脈粥樣硬化的形成。葉酸作為最近研究最多的膳食纖維化合物，已經(jīng)成為營養(yǎng)素預(yù)防疾病的熱門話題。研究發(fā)現(xiàn)葉酸可以調(diào)節(jié)同型半胱氨酸的代謝，拮抗因HHcy所致的主動脈組織B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)低甲基化，使B淋巴細(xì)胞瘤-2 mRNA表達(dá)水平降低，也許葉酸有拮抗粥樣斑塊進(jìn)一步發(fā)展的作用[20]。但其能否預(yù)防動脈粥樣硬化的發(fā)生還存在爭議。

雌激素能夠預(yù)防AS的發(fā)生而大豆中含有大豆異黃酮，其與雌激素有相似結(jié)構(gòu)，故又稱為植物雌激素。Fang等[21]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大豆異黃酮能夠通過抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶激活被甲基化的沉默基因。因此，黃豆的飲食療法可能將會成為預(yù)防AS的又一個方向標(biāo)。

5 中藥對基因甲基化修飾的調(diào)控

目前我國尚未研制出成熟的去甲基化藥物并且藥物細(xì)胞毒性較大，所以通過對甲基化修飾的調(diào)控來拮抗AS的進(jìn)一步發(fā)展的中藥研究更加成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。近期我國學(xué)者通過中藥作用DNA甲基化穩(wěn)定粥樣斑塊的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)：血府逐瘀膠囊和四季三黃膠囊聯(lián)合作用可使整個基因組甲基化水平增加而降低機(jī)體內(nèi)三酰甘油的含量，增加動脈內(nèi)斑塊的穩(wěn)定性，但對AS發(fā)生的作用還待進(jìn)一步確定[22]。而雌激素一直受各國心血管疾病研究人員的熱捧，在中藥治療AS的方面也不例外。有研究發(fā)現(xiàn)參茸補(bǔ)血丸可以調(diào)節(jié)甲基化水平，活化RNA聚合酶，增高雌激素水平[23]，所以參茸補(bǔ)血丸通過升高甲基化水平來拮抗AS值得深入探究。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎寧心煎可以抑制細(xì)胞黏附分子，提高 ERβ的表達(dá)，增強(qiáng)eNOS活性，抑制單核細(xì)胞趨化蛋白-1的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而緩解AS的早期病理損傷，因此可以進(jìn)一步研究補(bǔ)腎寧心煎是否可以通過調(diào)控甲基化作用干預(yù)AS的發(fā)生、發(fā)展。

6 結(jié)語和展望

DNA甲基化對AS影響的研究還處于初步階段，一些相關(guān)基因在什么條件下會發(fā)生甲基化，DNMT如何識別基因甲基化位點(diǎn)，甲基化影響基因轉(zhuǎn)錄的具體過程還需要更深入的探究。但是，目前研究報(bào)道提示基因甲基化是可以發(fā)生逆轉(zhuǎn)的，這將給AS的防治提供了明確的方向。DNMT3b可以使已經(jīng)去甲基化的特異性位點(diǎn)再次甲基化，我們將以此當(dāng)作突破口，阻斷DNMT識別DNA序列的甲基化位點(diǎn)，使其酶不能發(fā)揮甲基化作用。今后隨著特異性 DNA甲基化位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，可以探索抑制此位點(diǎn)甲基化的策略，恢復(fù)基因功能。同時，利用中藥調(diào)節(jié)基因甲基化水平來抑制AS的進(jìn)一步發(fā)展也將成為當(dāng)今研究的新方向標(biāo)。相信隨著學(xué)者更深入地研究，通過中西醫(yī)結(jié)合的方法能夠?qū)Νh(huán)境和遺傳相互作用所致的動脈粥樣硬化起到更好的防治作用。

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(本文編輯 郭懷印)

上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.12ZR1432600)；上海市科委項(xiàng)目(No.12401903400，14401972202)；上海市中西醫(yī)結(jié)合重點(diǎn)病種—慢性心衰建設(shè)項(xiàng)目(No.zxbz2012-08)

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院(上海201203)

王肖龍，E-mail：wxlqy0214@163.com

R543.5 R256.2

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2015．10．009

1672-1349(2015)10-1177-03

2015-04-03)