孟海艷，廉 如，陳顯久，王 彥

gAd對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶-1表達(dá)的影響

孟海艷1，廉 如2，陳顯久3，王 彥1

目的 探討脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域(gAd)對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶-1的影響。方法 用gAd蛋白干預(yù)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞，干預(yù)結(jié)束后用RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞脂肪酸分解途徑關(guān)鍵酶肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶-I轉(zhuǎn)錄水平的變化，用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶-1翻譯水平的變化。結(jié)果 與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶-1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)均顯著增高(P<0.001)，且呈劑量依賴性。結(jié)論 gAd蛋白能夠激活3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的分解途徑，促進(jìn)脂肪酸氧化。

脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域；3T3-L1脂肪細(xì)胞；肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶-1

脂聯(lián)素，又稱為脂肪細(xì)胞補(bǔ)體相關(guān)蛋白30KDa(Acrp30)，于1995年由Scherer等[1]首次在小鼠3T3脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。人脂聯(lián)素由247個(gè)氨基酸組成，包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域，球狀結(jié)構(gòu)域(gAd)為其活性域[2]。目前研究表明，脂聯(lián)素可以通過激活腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路增加外周組織，包括骨骼肌和脂肪組織對(duì)葡萄糖的攝取[3，4]，且已有研究報(bào)道了脂聯(lián)素可以通過激活A(yù)MPK通路增加大鼠心肌細(xì)胞的脂肪酸氧化[5]，那么，脂聯(lián)素對(duì)脂肪細(xì)胞脂肪酸的代謝有何影響呢？本研究擬用本課題組前期制備的gAd干預(yù)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞，探討gAd對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪酸分解途徑關(guān)鍵酶肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶-1(carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 脂聯(lián)素gAd，本課題組前期已成功制備[6]；3T3-L1前脂肪細(xì)胞株，山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科實(shí)驗(yàn)室凍存；DMEM/F12(1∶1)、高糖DMEM，GIBCO公司(美國(guó))；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物有限公司；胰酶、二甲基亞砜(DMSO)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、牛血清白蛋白(BSA)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，Sigma公司(美國(guó))；考馬斯亮藍(lán)試劑盒，南京建成生物公司；Trizol試劑，Invitrogen公司(美國(guó))；PCR引物，上海生物工程公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)，F(xiàn)ermentas公司(美國(guó))；PCR試劑盒(FastStart Universal SYBRGreen Mster)，Roche公司(美國(guó))；抗CPT抗體，江蘇希望生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 取本課題組前期制備的gAd蛋白，參照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行蛋白復(fù)性與濃度測(cè)定。取本實(shí)驗(yàn)室凍存的3T3-L1前脂肪細(xì)胞株，參考文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)分化和鑒定。

將誘導(dǎo)分化成熟后的3T3-L1脂肪細(xì)胞分別給予0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、300 ng/mL、1 000 ng/mL的gAd蛋白干預(yù)，上述干預(yù)每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加干預(yù)液4 mL，對(duì)照組加入等體積的生理鹽水，5 h后結(jié)束干預(yù)。

[8]的方法進(jìn)行常規(guī)總RNA的提取和常

規(guī)cDNA的合成。使用Primer引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)脂肪酸分解代謝關(guān)鍵酶肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-1的PCR引物。參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行RT-PCR操作、總蛋白的提取及Western blot操作。

2 結(jié) 果

2.1 gAd蛋白對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞CPT-1轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響 CPT-1是細(xì)胞內(nèi)脂肪酸β氧化的限速酶[9]。各組細(xì)胞CPT-1在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=381.854，P=0.000)，其中與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組(gAd濃度分別為10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、300 ng/mL、1 000 ng/mL)CPT-1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)均顯著增高(P<0.01)，且高劑量gAd對(duì)其表達(dá)的上調(diào)作用均顯著高于前一低劑量gAd(P<0.01)，詳見表1。

表1 gAd對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞CPT-I轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響(±s)

2.2 gAd蛋白對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞CPT-1翻譯水平表達(dá)的影響 進(jìn)一步以Western blot法對(duì)CPT-1進(jìn)行翻譯水平檢測(cè)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞CPT-1在翻譯水平的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=268.099，P=0.000)，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組(gAd濃度分別為10 ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、1000ng/mL)CPT-在翻譯水平的表達(dá)均顯著增高(P<0.01)，詳見圖1、表2。

注：1代表對(duì)照組；2 代表10 ng/mL gAd；3代表50 ng/mL gAd；4 代表100 ng/mL gAd；5代表300 ng/mL gAd；6代表1 000 ng/mL gAd。

圖1 CPT-1翻譯水平表達(dá)Wstern blot檢測(cè)電泳圖

表2 gAd對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞CPT-1翻譯水平表達(dá)的影響(±s)

3 討 論

脂聯(lián)素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，具有抗糖尿病、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎癥、保護(hù)心臟等重要的生物學(xué)活性[10-12]。gAd蛋白是脂聯(lián)素的活性結(jié)構(gòu)域，研究已證實(shí)，gAd蛋白可以通過激活A(yù)MPK通路促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞脂肪酸氧化[5]。本研究以3T3-L1脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶CPT-I在gAd蛋白干預(yù)后，其轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)均顯著增高，且均表現(xiàn)出劑量依賴性(P<0.01)，提示gAd可激活3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的β氧化途徑，促進(jìn)脂肪酸的分解代謝。

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(本文編輯 郭懷印)

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(太原 030001)；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市婦幼保健院；3.山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室

王彥，E-mail：wyroad@126.com

R329.2

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10．3969/j．issn．1672-1349．2015．10．008

1672-1349(2015)10-1175-02

2015-04-06)