董麗君，陳 鵬，程江濤

不同劑量野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈高壓模型的實(shí)驗(yàn)研究

董麗君，陳 鵬，程江濤

目的 觀察不同劑量的野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈高壓模型的建立，探索合適的野百合堿造模劑量。方法 將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分成4組，正常對(duì)照組、野百合堿低劑量組、野百合堿中劑量組和野百合堿高劑量組，一次性給予頸背部皮下注射不同劑量野百合堿誘導(dǎo)建立肺動(dòng)脈高壓大鼠模型。4周后，測量各組大鼠肺動(dòng)脈壓力、心輸出量、肺血管阻力以及右心室肥厚程度。 結(jié)果 野百合堿高劑量組大鼠死亡率、肺動(dòng)脈壓力、右心室室壁厚度高于中劑量組、低劑量組和正常對(duì)照組(P<0.001)，心輸出量低于中劑量組、低劑量組和正常對(duì)照組(P<0.001)；高劑量組肺動(dòng)脈壓力、肺血管阻力高于中劑量組、低劑量組(P<0.001)。 結(jié)論 中劑量組野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型更為接近大鼠肺動(dòng)脈模型的理想數(shù)值。

肺動(dòng)脈高壓；野百合堿；心輸出量；肺血管阻力；右心室肥厚

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)主要引起肺動(dòng)脈壓力升高、肺血管阻力增加，其形態(tài)學(xué)特征是肺動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)重建和右心室肥大。肺動(dòng)脈高壓一般分為原發(fā)性和繼發(fā)性，原發(fā)性少見，而繼發(fā)性肺動(dòng)脈高壓常見于由于各種慢性阻塞性肺疾病導(dǎo)致的缺氧或高原低氧環(huán)境，又被稱為低氧性，這是肺心病發(fā)生的核心環(huán)節(jié)；繼發(fā)性肺動(dòng)脈高壓還見于先天性心臟病大量血液分流，嚴(yán)重者最終成為器質(zhì)性梗阻性肺動(dòng)脈高壓，從而喪失外科手術(shù)的機(jī)會(huì)，預(yù)后不良，病死率居高不下[1，2]。 因此，對(duì)于肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)一步研究顯得尤為緊迫，而肺動(dòng)脈高壓模型的建立就顯得尤為重要。目前文獻(xiàn)中在眾多肺動(dòng)脈高壓模型的建立中，最常用的為野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型，野百合堿為一種雙吡咯類生物堿，經(jīng)血液循環(huán)后到達(dá)肺臟從而引起慢性血管炎性病變，接近臨床發(fā)病機(jī)制[3，4]。劑量通常為40 mg/kg、50 mg/kg和60 mg/kg，但對(duì)于哪一種劑量最為合適仍眾說紛紜。同時(shí)了解模型大鼠的血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)是其他相關(guān)研究的基礎(chǔ)，其中肺動(dòng)脈壓力、心輸出量和肺血管阻力都是檢測的相關(guān)重要指標(biāo)，也是評(píng)判模型是否成功的關(guān)鍵。文獻(xiàn)報(bào)道多采用改良后PE-50導(dǎo)管直接插入檢測大鼠的肺動(dòng)脈來檢測肺動(dòng)脈壓力，采用熱稀釋法測量大鼠心輸出量，同時(shí)進(jìn)一步計(jì)算出肺動(dòng)脈阻力，從而更為準(zhǔn)確反映出模型大鼠的心功能狀態(tài)[5]。本研究旨在通過實(shí)驗(yàn)找出最為適合的、病死率較低的、可靠的野百合堿造模劑量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物及儀器 Monocrotaline(購于美國Sigma公司)以無水乙醇和生理鹽水2∶8制備成1%的溶液，混勻，備用。水合氯醛(上海拓然生物有限公司)以生理鹽水溶解(6%)。肝素溶于生理鹽水配置濃度為25 U/mL。PE-50聚氯乙烯導(dǎo)管，生物探測儀機(jī)器配套的壓力換能器、溫度探測器和配套心排量導(dǎo)絲(MLT1402 T-type Ultra Fast Thermocouple Probe)購于上海Adinstrument儀器國際貿(mào)易公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠60只，體重180 g～220 g，購于上海第二軍醫(yī)大學(xué)。隨機(jī)分為4組，每組為15只。正常對(duì)照組腹腔注射乙醇生理鹽水2∶8的溶液，低劑量組頸背部一次性皮下注射野百合堿為40 mg/kg，中劑量組為50 mg/kg，高劑量組為60 mg/kg，同等環(huán)境下飼養(yǎng)28 d。

1.3 大鼠一般情況觀察 包括生長情況，飲食，毛發(fā)，呼吸，活動(dòng)，鼻腔、口腔和眼睛出血情況，有無感染及死亡情況。

1.4 肺動(dòng)脈壓力和心輸出量測定 大鼠飼養(yǎng)28 d后，大鼠肺動(dòng)脈壓力測定采用改良后的PE-50導(dǎo)管末端呈半圓弧型所行右心導(dǎo)管術(shù)測定；心輸出量采用熱稀釋法測定，肺血管阻力由肺動(dòng)脈壓力和心輸出量間接計(jì)算得出。大鼠稱重，6%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定后，備皮消毒，沿正中切開氣管插管后，用改良后的PE-50導(dǎo)管連通生物探測儀及壓力換能器經(jīng)右側(cè)頸靜脈插入肺動(dòng)脈后測得肺動(dòng)脈壓力波形及肺動(dòng)脈壓力，記錄并保存。獲得大鼠的肺動(dòng)脈壓力后在左側(cè)找到頸動(dòng)脈，將溫度探測儀連接心排量導(dǎo)絲沿頸動(dòng)脈插入4 cm～6 cm至胸主動(dòng)脈，然后沿右側(cè)上腔靜脈迅速注入(2 s～4 s)0 ℃～4 ℃生理鹽水0.2 mL～0.4 mL，觀察記錄儀上的溫度曲線變化，作好記錄并保存。

1.5 右心室肥厚指數(shù)測定 測量完畢，處死大鼠，完整取出大鼠心臟，切去心房，分離右心室(RV)及左心室和室間隔(LV+S)，用濾紙吸干水分后稱重、計(jì)算RV/(LV+S)值。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 模型組大鼠在皮下注射野百合堿1周之后開始出現(xiàn)動(dòng)物活動(dòng)量減少，毛發(fā)直豎，灰暗而且無光澤，呼吸明顯急促加快，食欲下降，消瘦。高劑量組在注射2周后死亡3只，4周后共死亡8只，中劑量組在注射2周后死亡1只，4周后死亡共2只，低劑量組及正常組未見死亡。死亡大鼠解剖后出現(xiàn)明顯肺淤血，肺表面不平整，彈性差，肺臟變大。4周之后實(shí)驗(yàn)組大鼠已明顯出現(xiàn)消瘦、呼吸困難、口腔及鼻腔出血、腹水形成，伴隨有肝臟腫大、心臟腫大、右心室室壁增厚等一系列心力衰竭表現(xiàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量統(tǒng)計(jì) 高劑量組在注射2周后死亡3只，4周后共死亡8只，中劑量組在注射2周后死亡1只，4周后死亡共2只，低劑量組及正常組未見死亡。最終共有50只大鼠符合結(jié)果分析(見表1)。最終檢測成功率分別為100%、98%和96%(見表2)。

表1 各組大鼠最終存活數(shù)量統(tǒng)計(jì) 只

表2 各組存活大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測最終成功率 %

2.3 各組大鼠肺動(dòng)脈壓力 低、中和高劑量野百合堿大鼠的平均肺動(dòng)脈壓力均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.001)，并且高劑量組肺動(dòng)脈壓力明顯高于中、低劑量組。詳見圖1、表3。

2.4 各組大鼠的心輸出量結(jié)果 低、中和高劑量野百合堿大鼠的心輸出量明顯低于正常對(duì)照組(P<0.001)。詳見表3。

2.5 各組肺血管阻力結(jié)果 低、中和高劑量野百合堿組大鼠肺血管阻力明顯高于正常對(duì)照組，且高劑量組明顯高于中低劑量組(P<0.001)。詳見表3。

2.6 各組大鼠右心室室壁厚度 與正常對(duì)照組相比，低、中、高劑量野百合堿組大鼠右心室不同程度增厚(P<0.001)。詳見表3。

正常對(duì)照組 低劑量組

中劑量組 高劑量組

圖1 各組大鼠肺動(dòng)脈壓力

表3 各組大鼠肺動(dòng)脈壓力、心輸出量、肺血管阻力、右心室室壁厚度比較(±s)

3 討 論

目前，肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型創(chuàng)建有很多種方法，包括野百合堿模型、慢性低氧模型、野百合堿聯(lián)合單側(cè)肺切除模型、慢性低氧聯(lián)合血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)拮抗劑SU5416以及現(xiàn)在發(fā)展迅速的基因工程造模方法[6-10]。但是眾多方法中最為常用的仍然為野百合堿和低氧誘導(dǎo)模型。這兩種方法具有廣泛性、簡潔性，并且在過去很長的一段時(shí)間內(nèi)為各種有關(guān)肺動(dòng)脈高壓的研究做出了巨大貢獻(xiàn)。 注射野百合堿后大鼠一般情況發(fā)生變化，動(dòng)物活動(dòng)量減少，毛發(fā)直豎，灰暗而且無光澤，呼吸明顯急促加快，食欲下降，逐漸消瘦。4周之后各組大鼠均已出現(xiàn)明顯體重下降、呼吸困難、口腔及鼻腔出血、腹水形成，伴隨有肝臟腫大、心臟腫大、右心室室壁增厚等一系列心力衰竭表現(xiàn)。經(jīng)測量大鼠的右心室壓和肺動(dòng)脈壓力明顯升高，心輸出量減少，右心室肥厚，肺血管阻力增加，表明應(yīng)用此法制備的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型成功。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)動(dòng)物飼養(yǎng)的環(huán)境也在實(shí)驗(yàn)中起著重要的作用，必須遠(yuǎn)離各種干擾因素。右心導(dǎo)管術(shù)導(dǎo)管的改良是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測量成功的關(guān)鍵。用熱稀釋法注入冰生理鹽水的過程中必須準(zhǔn)確快速，否則注入的冰鹽水越多，時(shí)間次數(shù)越多，心排量的測量越不準(zhǔn)確，動(dòng)物越容易死亡。 野百合堿制造動(dòng)物模型的方法操作比較簡便，并且一次性注射后3周～4周模型即可建立，但是仍然避免不了動(dòng)物模型后期因?yàn)樾牧λソ咭约案闻K淤血、腹水等原因引起死亡，并且死亡率較高，因此尋找此種方法中相對(duì)較為合適的野百合堿造模劑量是進(jìn)一步進(jìn)行其他相關(guān)研究成功的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)過程中分別采用40 mg/kg、50 mg/kg和 60 mg/kg三種不同劑量的野百合堿來觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同，注射后實(shí)驗(yàn)組大鼠在一般情況及血流動(dòng)力學(xué)方面出現(xiàn)不同程度的變化，但高劑量組出現(xiàn)變化的時(shí)間明顯早于其他組，嚴(yán)重程度也明顯較高。4周以后高劑量死亡率高達(dá)53.33%，有數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)表明此種劑量下的大鼠在5周以后死亡率高達(dá)35%，右心室的收縮壓甚至達(dá)到了80 mmHg，形成重度肺動(dòng)脈高壓[7-12]，則無法進(jìn)一步進(jìn)行其他相關(guān)類似藥理及機(jī)制方面的研究。雖然低劑量組的肺動(dòng)脈高壓形成過程較為緩和，4周后死亡率較低，但是最終觀察出的一般情況及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)較為接近正常對(duì)照組大鼠，出現(xiàn)接近肺高壓損傷的所需時(shí)間較長，有數(shù)據(jù)表明此劑量下大鼠的肺血管損傷增厚及纖維化不明顯。

雖然至今仍沒有一種完美的類似于肺動(dòng)脈高壓患者的動(dòng)物模型，但是野百合堿造模仍為現(xiàn)如今較為常用的方法，并且在肺動(dòng)脈高壓機(jī)制的研究及治療中起著重要的作用。綜上所述，必須同時(shí)兼顧血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)達(dá)準(zhǔn)、血管組織損傷形成和動(dòng)物的死亡率較低這幾項(xiàng)因素才是成功的動(dòng)物模型。50 mg/kg體重劑量的野百合堿造模，時(shí)間較短，死亡率較低，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和連續(xù)性較高，因此試驗(yàn)顯示此劑量形成大鼠肺高壓模型最為便捷，準(zhǔn)確可靠，能為進(jìn)一步的肺動(dòng)脈高壓機(jī)制研究和治療奠定基礎(chǔ)。

[1] Matsuda Y，Hoshikawa Y，Ameshima S，et al.Effects of peroxisome proliferator activated receptor gamma ligands on monocrotaline induced pulmonary hypertension in rats[J].Nibon Kokyuki Zasshi，2005(5)：283-288.

[2] Tan Albada ME，Schoemaker RG，Kemna MS，et al.The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension[J].Eur Respir J，2005(3)：487-493.

[3] 袁平，吳文匯，劉崠，等.改良后右心導(dǎo)管測定大鼠肺血管阻力的方法[J].中華心血管病雜志，2011，39：901-904.

[4] Hesel MH，Steendijk P，den Adel B，et al.Characterization of right ventricular function after monocrotaline induced pulmonary hypertension in the intact rat[J].Am J Physiol Heart Cric Physiol，2006，209：H2424-H2430.

[5] Kay JM，Harris P，Heath D.Pulmonary hypertension produced in rats by ingestion of Crotalaria spectabilis seeds[J].Thorax，1967(22)：176-179.

[6] Jasmin JF，Lucas M，Cernacek P，et al.Effective of a nonselective ETA/B and a selective ETA antagonist in rats with mono-crotaline-induced pulmonary hypertension[J].Circulation，2001，103：314-318.

[7] Obata H，Sakai Y，Ohnishi S，et al.Single injection of the a sustained-release prostacyclin analog improves pulmonary hypertension in rats[J].Am J Respir Crit Care Med，2008，177：195-201.

[8] Taraseviciene -Stewart L，Kasahara Y，Alger L，et al.Inhibition of the VEGF receptor 2 combined with chronic hypoxia causes cell death-dependent pulmonary endothelial cell proliferation and severe pulmonary hypertension[J].FASEB J，2001，15：427-438.

[9] Herget J，Palecek F.Pulmonary arterial blood pressure in closed chest rats.Changes after catecholamines，histamine and serotonin[J].Arch Int Pharmacodyn Ther，1972，198：107-117.

[10] Ishikawa M，Sato N，Asai K，et al.Effects a pure alpha/beta-adrenergic receptor blocker on monocrotaline-induced pulmonary hypertension with right ventricular hypertrophy in rats[J].Circ J，2009，73：2337-2341.

[11] Everett AD，Le Cras TD，Xue C，et al.eNOS expression is not altered in pulmonary vascular remodeling due to increased pulmonary blood flow[J].Am J Physiol，1998，274(6)：L1058-1065.

[12] 王俊東，楊達(dá)寬，李治綱，等.野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈高壓模型的建立[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，28：5237-5240.

(本文編輯 郭懷印)

Experimental Study on Different doses of Monocrotaline-induced Pulmonary Hypertension in Rats

Dong Lijun，Chen Peng，Cheng Jiangtao

The First Affiliated Hospital，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450000，Henan，China

Cheng Jiangtao

Objective To investigate the different doses of monocrotaline induced pulmonary hypertension and explore situable monocrotaline dose to model pulmonary hypertension.Methods Sixty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups，normal control group，low dose group，middle dose group and high dose group，rats were given subcutaneous injection of appropriate doses of monocrotaline disposably in order to induce the formation of pulmonary hypertension.After our weeks，the pulmonary arterial pressure，cardiac output，pulmonary vascular resistance and right ventricle hypertrophy were measured.Results The mortality rate in high dose group was higher than that in low-dose group and control group.Mean pulmonary arterial pressure and right ventricular wall thickness in high doses group was higher than that in moderate dose group，low dose group，and control group(P<0.001).Cardiac output in high doses group was lower than that in moderate dose group，low dose group，and control group(P<0.001).Conclusion The moderate dose monocrotaline induced pulmonary hypertension is closer to the ideal value model.

pulmonary arterial hypertension；monocrotaline；cardiac output； right ventricle hypertrophy

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81273948)

河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(鄭州 450000)

程江濤，E-mail：chengjt9888@163.com

R563 R256.1

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2015．10．007

1672-1349(2015)10-1172-04

2015-02-11)