鄭俊華，唐浩然，景麗英，羅瓊珍

心肌缺血再灌注損傷中TNF-α血清水平表達(dá)對(duì)心肌收縮功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

鄭俊華，唐浩然，景麗英，羅瓊珍

目的 探討心肌缺血再灌注損傷中腫瘤壞死因子α(TNF-α)血清水平表達(dá)對(duì)心肌收縮功能的影響。方法 用健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠制作心肌缺血再灌注損傷模型。連接BioLab-410型生物信號(hào)采集和處理系統(tǒng)，記錄心電圖，測(cè)定并記錄心肌缺血前、缺血30 min及再灌注30 min、60 min、90 min、120 min各個(gè)時(shí)相點(diǎn)血清中TNF-α水平和平均動(dòng)脈壓(MAP)、心肌收縮功能，分析TNF-α水平與心肌收縮功能相關(guān)性。結(jié)果 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后30 min，大鼠血清中TNF-α較缺血前明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，再灌注后較缺血前、缺血30 min顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，再灌注后維持在較高水平。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎30 min后，MAP、心率(HR)、左室收縮末壓(LVSP)、左室內(nèi)壓最大變化速率(±dp/dtmax)明顯降低，左室舒張末壓(LVEDP)明顯增高，與缺血前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與缺血前、缺血30 min比較，再灌注后MAP、HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax顯著降低，LEVDP顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 心肌缺血再灌注損傷中血清TNF-α水平的表達(dá)與心肌收縮功能出現(xiàn)平行的同向變化趨勢(shì)，具有明顯的相關(guān)性，TNF-α血清水平升高會(huì)抑制心肌收縮功能。

心肌缺血；再灌注損傷；腫瘤壞死因子；心肌收縮功能

心臟缺血性疾病的發(fā)病率和致死率在世界范圍內(nèi)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]，嚴(yán)重危害人類健康。心肌持續(xù)性缺血可導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞死亡。心肌缺血最有效的治療措施是恢復(fù)血液供應(yīng)，缺血后恢復(fù)血流供應(yīng)的過程稱為再灌注，盡管早期再灌注對(duì)組織非常重要，但再灌注可使缺血心肌損傷加重，即產(chǎn)生心肌缺血再灌注損傷(ischermic reperfusion injury，IRI)[2，3]。研究發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)在心肌缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮了重要作用[4]。近年來，腫瘤壞死因子與缺血再灌注損傷的關(guān)系以及抗腫瘤壞死因子治療日益受到重視。研究結(jié)果顯示，有效降低TNF-α水平，可增加射血分?jǐn)?shù)，減少缺血再灌注心臟發(fā)生新功能不全延緩心室重塑、減少心肌細(xì)胞凋亡及降低死亡率[5]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，觀察血清中TNF-α表達(dá)水平對(duì)心肌收縮功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔(clean，CL)級(jí)健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠57只，年齡12周，體重250 g～300 g，購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證：SCXK(粵)2006-0015。

1.2 儀器 TKB-200C型小動(dòng)物呼吸機(jī)(江蘇省特力麻醉呼吸設(shè)備公司)；DT-8836紅外線體溫加熱器(深圳市杰能寶智能科技有限公司)；BioLab-410型生物信號(hào)采集和處理系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；U型水銀壓力計(jì)(自制)；電子天平。

1.3 藥品與試劑 3%戊巴比妥鈉；TNF-α ELLSA檢測(cè)試劑盒(上海依科賽有限公司)。

1.4大鼠活體心肌缺血再灌注損傷模型建立

1.4.1 參照文獻(xiàn)[6]的方法改良進(jìn)行建模 大鼠均用3%戊巴比妥鈉1 mL/kg腹腔注射麻醉，為控制呼吸道分泌物，術(shù)前給予阿托品。連接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，記錄心電圖。待SD大鼠麻醉后，常規(guī)去毛，消毒皮膚，剪皮，鈍性分離并暴露氣管，切開立即用24G×0.75、0.7mm×1.9mm規(guī)格的靜：脈留置針前軟管(1.5 mm×2.0 mm)行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，調(diào)節(jié)潮氣量維持在1 mL/100 g～1.5 mL/100 g，呼吸次數(shù)80次/min～100次/min，I∶E=1∶2，壓力在5 cmH2O～15 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)之間，根據(jù)呼吸頻率及強(qiáng)度調(diào)整呼吸參數(shù)。采用紅外線體溫加熱器維持體溫在36.5 ℃～37.0 ℃。開胸手術(shù)：大鼠采用右側(cè)臥位，暴露左側(cè)腋窩，從左腋窩下緣做橫行切口至左胸骨旁剪開皮膚，距離胸骨中線約2 mm，整個(gè)橫行切口大約8 mm。逐層分離，剪斷胸大小肌，暴露胸壁肋間隙，在第3～5肋間隙鈍性分離肋間肌，進(jìn)入胸腔。采用自制拉鉤，以四角撐開肋間隙暴露范圍6 mm～8 mm，剝離心包膜充分顯露左心耳及左心室。在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間，找到于心肌內(nèi)與心大靜脈走向一致的冠狀動(dòng)脈左前降支，在左心耳根部1 mm～2 mm處，以3/8號(hào)帶線縫合針穿線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，結(jié)

扎線下置雙股2號(hào)線作松解用。阻斷左冠狀動(dòng)脈30 min，再灌注，造成心肌缺血再灌注損傷模型。動(dòng)物模型成功標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，肉眼觀心臟左室壁出現(xiàn)變暗變紫，心電圖顯示ST段弓背向上抬高(>0.25 mV)，QRS波增寬；30 min后，松開活結(jié)再灌注，可觀察到缺血區(qū)心肌慢慢變紅色，發(fā)紺區(qū)變小，心電圖ST段逐漸下降[7]。

1.4.2 平均動(dòng)脈血壓和心肌收縮功能 左側(cè)股動(dòng)脈插管，連接三通和U型水銀血壓計(jì)，用于記錄平均動(dòng)脈血壓(MAP)，右側(cè)頸總動(dòng)脈插管至左心室，連接BioLab-410型生物信號(hào)采集和處理系統(tǒng)測(cè)定心率(HR)、左室收縮末壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)和左室內(nèi)壓最大變化速率(±dp/dtmax)。記錄心肌缺血前、缺血后30 min和再灌注后30 min、60 min、90 min和120 min不同時(shí)相點(diǎn)的平均動(dòng)脈血壓和心肌收縮功能變化。

1.4.3 血清中TNF-α水平測(cè)定 采集心肌缺血前、缺血后30 min和再灌注后30 min、60 min、90 min和120 min不同時(shí)相點(diǎn)動(dòng)脈血。均經(jīng)腹主動(dòng)脈快速抽取動(dòng)物血3.0 mL～4.0 mL，以3 000 r/min離心15 min，分離出血清，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存，按ELLSA檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料采用配對(duì)t檢驗(yàn)或單因素隨機(jī)區(qū)組方差分析。采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分析 實(shí)驗(yàn)所用SD大鼠57只，造模死亡6只，主要是因?yàn)榻Y(jié)扎時(shí)大出血死亡1只，麻醉意外死亡1只，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支后心律失常死亡2只，再灌注后心律失常死亡2只。

2.2 平均動(dòng)脈血壓和心肌收縮功能變化 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎30 min后，MAP、HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯降低，LEVDP明顯增高，與缺血前比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與缺血前比較，再灌注后MAP、HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax顯著降低，LEVDP顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；再灌注后比缺血30 min時(shí)MAP、HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯下降，LEVDP明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且再灌注后MAP、HR、LVSP、及+dp/dtmax、-dp/dtmax在30 min時(shí)最低，60 min及以后均有所上升，LEVDP在30 min時(shí)最高，60 min后有所降低，但仍維持較高水平。詳見表1。

表1 缺血前后及再灌注后各個(gè)時(shí)相點(diǎn)MAP和心肌收縮功能的比較(±s)

2.3 血清中TNF-α水平測(cè)定結(jié)果 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后30 min，大鼠血清中TNF-α明顯增高，與缺血前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；再灌注后比缺血前、缺血30 min顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且可見TNF-α再灌注30 min時(shí)含量最高，達(dá)到峰值，而在再灌注60 min呈現(xiàn)輕度下降，但在90 min～120 min仍維持較高水平。詳見表2。

表2 缺血前后及再灌注后各個(gè)時(shí)相點(diǎn)

2.4 血清中TNF-α水平與平均動(dòng)脈壓和心肌收縮功能的相關(guān)性分析 表1結(jié)果顯示，缺血前、缺血后及再灌注各個(gè)時(shí)相點(diǎn)平均動(dòng)脈壓和心肌收縮功能的變化基本一致。對(duì)比表1和表2，可見血清中TNF-α水平與心肌收縮功能出現(xiàn)平行的同向變化趨勢(shì)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理顯示兩者間存在顯著相關(guān)性。缺血30 min時(shí)，TNF-α明顯高于缺血前，心肌收縮功能較缺血前明顯降低；再灌注30 min時(shí)，TNF-α顯著高于缺血前、缺血30 min，心肌收縮功能較缺血前、缺血30 min顯著降低，并且此時(shí)TNF-α峰值最大，同時(shí)心肌收縮功能峰值最小；隨著再灌注進(jìn)行到60 min、90 min和120 min時(shí)相點(diǎn)，TNF-α略低于再灌注30 min，但是仍然維持在較高水平，同時(shí)在60 min、90 min和120 min時(shí)相點(diǎn)時(shí)，心肌收縮功能相對(duì)于再灌注30 min有所上升，但是整體水平仍然保持在較低水平。隨著TNF-α逐漸上升心肌收縮功能逐漸下降。

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷是臨床心絞痛、急性心肌梗死(AMI)早期再灌注、經(jīng)皮穿刺冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)及心臟移植術(shù)后等心功能不全和心律失常的主要病理基礎(chǔ)[8，9]，再灌注性心律失常是心肌缺血再灌注損傷中的一種主要表現(xiàn)形式，特別是室性心動(dòng)過速及心室顫動(dòng)。研究證實(shí)缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，可減少惡性心律失常的發(fā)生。心肌缺血再灌注損傷的臨床表現(xiàn)是心肌收縮功能下降、冠脈功能障礙、微小血管受損，并發(fā)生心肌組織水腫、黏附因子增加和白細(xì)胞浸潤(rùn)，從而引起細(xì)胞凋亡與心肌梗死，最終導(dǎo)致心臟功能減弱[10]。Sihvola等[11]的實(shí)驗(yàn)也顯示TNF-α參與心肌重構(gòu)的過程，是心肌凋亡的中介環(huán)節(jié)。并且TNF-α有直接的負(fù)性肌力作用，還可使細(xì)胞及生化異常，產(chǎn)生間接的負(fù)性肌力作用，抑制心肌收縮功能。TNF-α主要是有激活單核巨噬細(xì)胞分泌的一類以自分泌為主要作用方式，并且有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，產(chǎn)生于單核巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、某些應(yīng)激狀態(tài)下的成熟心肌細(xì)胞及體內(nèi)多種其他細(xì)胞。健康心臟中僅有極低含量表達(dá)。在缺血和應(yīng)激狀態(tài)下，TNF-α可由成熟心肌細(xì)胞合成、分泌并參與多種心臟疾病的病理過程。 本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)心臟冠狀動(dòng)脈結(jié)扎30 min再灌注后TNF-α含量明顯增加，表明心肌組織進(jìn)行再灌注時(shí)產(chǎn)生大量的TNF-α。TNF-α通過激活肽水解酶及蛋白水解酶講解關(guān)鍵性收縮蛋白，包括肌鈣蛋白，影響心肌收縮。TNF-α水平的升高與心肌功能抑制有明顯的相關(guān)性，在心肌缺血再灌注損傷發(fā)展過程中。TNF-α可導(dǎo)致缺血后心肌功能不良，其主要機(jī)制是通過對(duì)心肌收縮力的直接影響而抑制心肌收縮功能和誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。

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(本文編輯 郭懷印)

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