韓建文 白云花 孫志強(qiáng) 阿拉騰楚魯 劉佳 呂新翔 烏日娜

銀屑病是一種以紅斑、鱗屑為主要表現(xiàn)的慢性炎癥性皮膚病，遺傳因素在銀屑病發(fā)病中起到重要作用［1-2］，在中國患病率為 0.47%［3］。近年來遺傳關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)一大批銀屑病相關(guān)的易感基因［4-6］。特別是一些易感基因與其他自身免疫病有重疊（例如潰瘍性結(jié)腸炎、克隆病、強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乳糜瀉等）［1］。參與核因子 κB（NF-κB）病理通路的人腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3（TNFAIP3）相互作用蛋白1（TNIP1）基因在不同人種的多項(xiàng)研究中均有報(bào)道，包括中國北方漢族人群［7-8］。為研究TNIP1基因與中國漢族人群相關(guān)性，我們選擇位于TNIP1基因區(qū)域的3個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP），利用連接酶檢測反應(yīng)（ligase detection reaction，LDR）對其進(jìn)行基因分型，探討其與尋常性銀屑病的相關(guān)性。

對象和方法

一、對象

1.研究對象：從內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收集尋常性銀屑病患者465例，年齡（42.40±17.67）歲，發(fā)病年齡（30.91±14.36）歲；男女比例為294/171。健康對照476例，年齡（38.10±16.00）歲，男女比例為225/251。所有研究對象均為漢族人。經(jīng)知情同意并簽字后抽取外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋ谢颊呓?jīng)臨床及病理診斷，符合尋常性銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)。健康對照排除銀屑病及其他自身免疫疾病，排除銀屑病家族史。本研究經(jīng)過內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并在實(shí)施過程中遵守赫爾辛基宣言。

2.SNP選擇：根據(jù)既往文獻(xiàn)選擇3個SNP（rs17728338、rs3762999和rs999556）進(jìn)行分型實(shí)驗(yàn)［7-9］。

二、方法

1.基因組DNA提?。豪肁xyPrep,AP-MX-BLGDNA-25基因組DNA提取試劑盒提取患者及對照基因組DNA，利用分光光度儀檢測260和280 nm吸光度，計(jì)算DNA濃度。并利用凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，所有DNA樣本均合格。

2.引物及探針的合成：利用Primer 3 online（Version 0.4.0）軟件（http://frodo.wi.mit.edu/）和 Oligo（Version 6.31）（Molecular Biology Insights Inc.,USA）軟件設(shè)計(jì)特異性引物和LDR探針，針對每個SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)2條引物，盡量保證所有SNP位點(diǎn)引物的T值相同，PCR引物序列見表1。根據(jù)LDR探針設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)LDR的上下游探針［10-11］，上游探針5′端用磷酸化修飾，LDR探針序列見表2。

3.多重 PCR：PCR 反應(yīng)體系（20 μl）為：1μl模板 ，2 μl 緩沖液 ，0.6 μl Mg2+，2 μl dNTP，0.2 μl TaqDNA聚合酶，2 μl引物混合液，加水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min，94℃30s，56℃退火1.5min，65℃30 s，35個循環(huán)。最后65℃延伸10 min。

4.多重 LDR：LDR 反應(yīng)體系 （10 μl） 為：1 μl Buffer緩沖液，1 μl探針混合液，0.05 μl Taq DNA 連接酶，4 μl PCR 產(chǎn)物，加水補(bǔ)足 10 μl。探針混合液濃度為2 μmol/L。LDR反應(yīng)條件：95℃2 min預(yù)變性，94℃ 15 s，50℃ 25 s，進(jìn)行 40個循環(huán)。

表1 針對不同單核苷酸多態(tài)性的PCR引物序列

表2 針對不同單核苷酸多態(tài)性的連接酶檢測反應(yīng)探針序列

5.測序與基因分型：反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過ABI3730測序儀測序分析，最后用Genemapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，判讀各位點(diǎn)上各樣本的基因分型。

6.統(tǒng)計(jì)分析：所有SNP分型數(shù)據(jù)質(zhì)控、統(tǒng)計(jì)分析利用PLINK 1.07軟件完成（http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/）［12］。計(jì)算 3 個 SNP 的等位基因頻率，在病例組及對照組中分別進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)?？ǚ綑z驗(yàn)比較病例組及對照組等位基因頻率及基因型頻率，并計(jì)算等位基因的相對危險(xiǎn)度估計(jì)值比值比OR及其95%可信區(qū)間（95%CI）。對3個SNP間進(jìn)行連鎖不平衡檢驗(yàn)，計(jì)算兩兩間的r2和D′值。根據(jù)患者發(fā)病年齡（早發(fā)型：發(fā)病年齡＜40歲；晚發(fā)型：發(fā)病年齡≥40歲）及有無銀屑病家族史進(jìn)行分層分析。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，根據(jù)Bonferroni多重檢驗(yàn)校正原理，P＜0.0167（0.05/3）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、樣本及SNP質(zhì)控

病例組及對照組在性別及年齡分布方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。3個SNP在病例及對照中均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。

二、等位基因頻率及基因型頻率比較

rs17728338等位基因頻率在尋常性銀屑病組及各型病例組均顯著高于對照組（P＜0.016 7）。rs3762999和rs999556等位基因頻率在尋常性銀屑病組和對照組間差異未達(dá)到Bonferroni校正水平，但是有家族史組顯著高于對照組（P＜0.0167）。見表3、4。

在不同遺傳模式下比較病例組和對照組間基因型頻率，發(fā)現(xiàn)在顯性遺傳模式下，3個SNP的基因型頻率在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在隱形遺傳模式下差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分層分析顯示，在顯性遺傳模式下，早發(fā)型、晚發(fā)型、有家族史、無家族史病例組rs17728338基因型頻率與對照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.016 7）。顯性模式下，rs3762999和rs999556基因型頻率在有家族史組與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.016 7）；rs999556基因型頻率在早發(fā)型病例組與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01）。見表 5、6。

三、3個SNP間的連鎖不平衡分析

rs3762999與rs999556間存在強(qiáng)連鎖不平衡（r2=0.91，D′=0.98），rs17728338 與 rs3762999 和rs999556之間有中等程度的連鎖不平衡（r2分別為0.37 和 0.35，D′分別為 0.99 和 1.00）。

討 論

最早Nair等［8］在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)TNIP1與銀屑病的相關(guān)性，此后在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)。2010年Sun等［7］首次報(bào)道中國人群中TNIP1與銀屑病的相關(guān)性，Yang等［9］也得出相同的結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)rs17728338與關(guān)節(jié)病性銀屑病也具有相關(guān)性，其等位基因A的頻率在中國人群（0.089）高于歐洲人群（0.056）［7-9］，但根據(jù)OR值看出其對疾病的影響均為增加患病風(fēng)險(xiǎn)。我們分層分析發(fā)現(xiàn)，rs17728338的基因型頻率在早發(fā)型、晚發(fā)型、有家族史、無家族史尋常性銀屑病組與對照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且均顯示為顯性遺傳模式。Sun等［7］除發(fā)現(xiàn)rs17728338的相關(guān)性外，還發(fā)現(xiàn)另外2個位于TNIP1基因區(qū)域的SNP（rs3762999和rs999556）與銀屑病也具有相關(guān)性。在本研究結(jié)果中，rs3762999和rs9995562等位基因頻率在銀屑病組和健康對照中存在差異，但是經(jīng)過多重檢驗(yàn)校正后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在不同遺傳模式下統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)在顯性遺傳模式下這2個SNP的基因型頻率在病例組和對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且達(dá)到Bonferroni校正水平（P＜0.016 7）。rs3762999和rs9995562基因型頻率在有家族史組與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；颊甙l(fā)病年齡分層分析顯示，只有rs9995562與早發(fā)型相關(guān)，未發(fā)現(xiàn)rs3762999的相關(guān)性。這些結(jié)果提示，家族史陽性是尋常性銀屑病發(fā)病的一個明顯的易感因素，TNIP1基因多態(tài)性對家族史陽性患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響更大，并且這種影響在顯性遺傳模式下更為顯著。查詢r(jià)s3762999及rs999556在既往研究中的等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)本研究中這2個SNP的等位基因頻率與Sun等［7］的報(bào)道類似。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，rs17728338與rs3762999及rs999556兩個SNP均具有中等程度的連鎖不平衡。以上結(jié)果提示這3個SNP可能代表同一個關(guān)聯(lián)信號。

表3 尋常性銀屑病患者rs17728338、rs3762999和rs999556等位基因頻率分析

表4 尋常性銀屑病和對照組中rs17728338、rs3762999和rs999556基因型分布及分層分析

表5 顯性模式下尋常性銀屑病和對照組中rs17728338、rs3762999和rs999556基因型分布及分層分析

表6 隱性模式下尋常性銀屑病和對照組中rs17728338、rs3762999和rs999556基因型分布及分層分析

TNIP1基因位于5q32-q33.1，其信使 RNA（mRNA）廣泛表達(dá)于外周白細(xì)胞、脾臟、骨骼肌及腎臟。編碼蛋白A20結(jié)合NF-κB抑制蛋白1（ABIN1）與其配體A20蛋白結(jié)合參與NF-κB的抑制。TNIP1基因過表達(dá)可以通過抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）而抑制 NF-κB 活性［13］。TNIP1 還可以不依賴 A20 而抑制 TNF 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［14-15］。此外涉及 NF-κB 病理通路的其他基因的變異也與銀屑病具有關(guān)聯(lián)性，例如禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒癌基因V-Rel同源基因 （REL）［16-17］、核因子 κB 抑制蛋白 α 亞基（NFKB1A）［18-19］及 TNFAIP3［8］。其中 TNIP1 和 TNFAIP3也是多種自免疫相關(guān)疾病的易感基因，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、乳糜瀉、潰瘍性結(jié)腸炎、克隆病、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等［20-21］。這些遺傳學(xué)證據(jù)提示，NF-κB病理通路可能是銀屑病發(fā)病過程中一個重要的環(huán)節(jié)。最近研究顯示，TNFAIP3基因多態(tài)性與銀屑病患者對TNF拮抗劑的治療反應(yīng)相關(guān)［22］。是否TNIP1也具有類似作用，還需要進(jìn)一步研究。

我們通過對TNIP1基因區(qū)域rs17728338與rs3762999和rs999556三個SNP進(jìn)行分型研究，證實(shí)其與中國漢族人尋常性銀屑病的相關(guān)性，更進(jìn)一步提示TNIP1基因在銀屑病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。但是本研究尚有一些不足之處，第一，本研究基于單個基因的多態(tài)性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，基因-基因間復(fù)雜交互作用未能明確，而龐大的基因網(wǎng)絡(luò)中相互作用非常廣泛和復(fù)雜，這些遺傳變異與疾病易感性的相關(guān)性是否會受到其他基因的影響尚不能確定；第二，這3個多態(tài)性并非影響基因表達(dá)的功能變異，TNIP1基因多態(tài)性如何影響其基因功能以及免疫系統(tǒng)功能，仍需要進(jìn)一步研究。

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