劉文玉，顏雪琴，林祥群，魏長慶

(1.新疆石河子職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆石河子 832000；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000)

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響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2萃取葡萄籽原花青素工藝

劉文玉1，顏雪琴1，林祥群1，魏長慶2*

(1.新疆石河子職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆石河子 832000；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000)

[目的]以乙醇為提取溶劑進(jìn)行超臨界CO2萃取葡萄籽原花青素的工藝研究。[方法]采取單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)葡萄籽中原花青素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]試驗(yàn)得到葡萄籽中原花青素提取工藝的最佳條件：乙醇體積分?jǐn)?shù) 69.22%，CO25 L/h，提取時(shí)間62.82 min，料液比1∶1.13 g/ml，提取溫度55 ℃，提取壓力35 MPa。在此條件下葡萄籽中原花青素產(chǎn)率理論值為164.916 mg/kg，實(shí)測值為(163.60±0.93)mg/kg，原花青素的純度為88.5%。[結(jié)論] 研究可為促進(jìn)新疆葡萄資源的綜合利用提供參考和理論指導(dǎo)。

葡萄籽；原花青素；超臨界萃??；響應(yīng)面法

我國葡萄種植面積世界第一，釀酒葡萄面積也居前列。石河子市作為新疆優(yōu)質(zhì)葡萄產(chǎn)地之一，目前已建成1.67萬hm2優(yōu)質(zhì)葡萄生產(chǎn)基地，近幾年，葡萄深加工產(chǎn)業(yè)在石河子迅速發(fā)展，如知名企業(yè)中信國安酒業(yè)，張?jiān)Ｆ咸丫魄f園現(xiàn)已落戶于石河子。然而，在葡萄加工過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的加工廢棄物葡萄籽。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽占葡萄的5%～7%。葡萄籽多酚類物質(zhì)原花青素占葡萄籽成分的80%～85%，原花青素具有抗癌、抗氧化等藥理作用，還對(duì)骨質(zhì)疏松、腎結(jié)石等病癥有緩解作用[1-5]。由于原花青素所具有的抗氧化作用，現(xiàn)今廣泛運(yùn)用于醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)[6-8]。在釀酒業(yè)，葡萄籽是葡萄酒廠的大宗下腳料，年產(chǎn)量約5萬～7萬t[9]，若能將下腳料葡萄籽更好地利用起來，會(huì)給葡萄行業(yè)帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。因此，開展對(duì)以葡萄籽為原料制備GSPE的研究逐步成為熱點(diǎn)。因此，筆者以新疆石河子墾區(qū)釀酒葡萄籽為原料，對(duì)超臨界CO2萃取葡萄籽原花青素的工藝進(jìn)行技術(shù)研究，為促進(jìn)新疆葡萄資源的綜合利用提供參考和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要原料與試劑。葡萄籽：葡萄籽由新疆西域酒業(yè)有限公司提供；低聚原花青素標(biāo)樣：購買于烏魯木齊市疆域綠色營養(yǎng)源研究院(有限公司)；乙醇、石油醚、甲醇、丙酮、鹽酸等試劑均為分析純，購于天津永晟精細(xì)化工有限公司。

1.1.2主要儀器。紫外可見分光光度計(jì)(756MC)，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；超聲循環(huán)提取機(jī)(HF-2B)，北京弘祥隆生物技術(shù)發(fā)展有限公司 ；BS 2000S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；電熱恒溫水浴鍋(HH-42)，常州國華電器有限公司；FZ-6型萬能粉碎機(jī)，溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠；BCD-203 YM海信電冰箱，海信(北京)電器；Neofage 15R臺(tái)式離心機(jī)，利康有限發(fā)展公司。

1.2 方法

1.2.1料液比對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響。對(duì)葡萄籽原料進(jìn)行破碎，并用石油醚脫脂預(yù)處理作為樣品，稱取一定量樣品，用乙醇提取，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，CO2流量5 L/h，提取溫度55 ℃，提取時(shí)間60 min，提取壓力35 MPa，按物料∶溶劑體積比為1∶0.8，1∶1.0，1∶1.2，1∶1.4，1∶1.6，1∶1.8 g/ml加入乙醇溶液。研究料液比對(duì)原花青素提取率的影響。

1.2.2溫度對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響。稱取一定量樣品，提取乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，CO2流量5 L/h，提取時(shí)間60 min，提取壓力35 MPa，料液比為1∶1.2 g/ml，萃取溫度為45、50、55、60、65、70 ℃，研究萃取溫度對(duì)原花青素提取率的影響。

1.2.3CO2流量對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響。稱取一定量樣品，提取溫度55 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶1.2 g/ml，提取時(shí)間60 min，提取壓力35 MPa，CO2流量按5、10、15、20、25、30 L/h，研究CO2流量對(duì)原花青素提取率的影響。

1.2.4夾帶劑濃度對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響。稱取一定量樣品，提取溫度55 ℃，料液比為1∶1.2 g/ml，CO2流量5 L/h，提取時(shí)間60 min，提取壓力35 MPa，夾帶劑選取乙醇，濃度設(shè)為40%、50%、60%、70%、80%、90%，研究夾帶劑濃度對(duì)原花青素提取率的影響。

1.2.5提取時(shí)間對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響。稱取一定量樣品，提取溫度55 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，CO2流量5 L/h，料液比1∶1.2 g/ml，提取壓力35 MPa，萃取時(shí)間為30、45、60、75、90、105 min，研究萃取時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響。

1.2.6提取壓力對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響。稱取一定量樣品，提取溫度55 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，CO2流量5 L/h，提取時(shí)間60 min，料液比1∶1.2 g/ml，提取壓力20、25、30、35、40、45 MPa，研究提取壓力對(duì)原花青素提取率的影響。

1.2.7原花青素純度的測定。采用正丁醇-鹽酸法測定超臨界CO2提取物中原花青素純度[12]。

提取物中原花青素純度=[原花青素總量(mg)/葡萄籽提取物總量(mg)]×100%

1.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參照單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)原花青素提取率有顯著影響的因素。以原花青素的提取率為響應(yīng)值，回歸分析采用STATISTICA對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行，以-1、0、1對(duì)每一自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別編碼，以最小二乘法擬合二次多項(xiàng)式方程建立模型，由F值檢驗(yàn)其統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性，原花青素提取的最佳條件及提取率的最大值采用STATISTICA分析預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1料液比對(duì)原花青素產(chǎn)率的影響。由圖1可知，隨著溶劑的增大，提取率呈現(xiàn)上升后下降的趨勢，當(dāng)液料比為1∶1.2 g/ml時(shí)比提取率最大。分析原因，可能是溶劑太多，降低了超臨界流體與溶質(zhì)、溶劑之間的接觸面積，減弱了流體萃取溶質(zhì)的能力；也可能由于太多的溶劑溶解了其他雜質(zhì)，影響乙醇溶解原花青素的效果，降低了原花青素的產(chǎn)率。

2.1.2萃取溫度對(duì)原花青素產(chǎn)率的影響。由圖2可知，隨著溫度的升高，原花青素的提取率先增加后下降。分析原因，溫度升高，可提高提取率，但溫度過高，會(huì)導(dǎo)致原花青素發(fā)生氧化，破壞原花青素的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率降低。

2.1.3CO2流量對(duì)原花青素產(chǎn)率的影響。CO2流速增大導(dǎo)致CO2流量增加，增加相對(duì)溶劑密度，對(duì)萃取有利，但對(duì)較小溶解度的溶質(zhì)或溶質(zhì)從原料擴(kuò)散出來很慢的體系，由于溶質(zhì)與物料的接觸時(shí)間減少，不利于萃取。CO2流量對(duì)原花青素產(chǎn)率的影響見圖3。

2.1.4夾帶劑濃度對(duì)原花青素產(chǎn)率的影響。從圖4可知，原花青素提取率隨乙醇濃度的增大而先增加后降低。分析原因，可能是相似相溶原理，原花青素中含有一定的極性大量羥基的多酚類化合物，當(dāng)溶劑的極性與原花青素的極性相當(dāng)時(shí)，原花青素溶解度最大，提取量最多，故隨乙醇濃度增加，原花青素溶解度增加，當(dāng)乙醇濃度再增大，極性差距增大導(dǎo)致溶解度降低，提取量反而降低，也可能是隨著濃度增加，一些醇溶性雜質(zhì)與原花青素競爭同乙醇一水分子結(jié)合，導(dǎo)致原花青素提取量下降。試驗(yàn)證明，乙醇濃度為70%時(shí)，原花青素提取量最大。

2.1.5萃取時(shí)間對(duì)原花青素產(chǎn)率的影響。如圖5所示，原花青素的提取率隨提取時(shí)間的延長而增高，當(dāng)提取時(shí)間超過60 min時(shí)，提取率又開始下降，分析原因，這是由于隨著提取時(shí)間的延長，原花青素不斷從葡萄子細(xì)胞中溶出；當(dāng)達(dá)到最高值后繼續(xù)延長提取時(shí)間，原花青素由于長時(shí)間受熱，其結(jié)構(gòu)遭到破壞，原花青素被分解，降低了提取率。試驗(yàn)證明，最佳提取時(shí)間為60 min。

2.1.6萃取壓力對(duì)原花青素產(chǎn)率的影響。由圖6可知，萃取壓力在20～45 MPa范圍內(nèi)，原花青素產(chǎn)率隨著壓力的升高不斷增加。而在20～35 MPa，壓力的增加對(duì)產(chǎn)率的增加有明顯的促進(jìn)作用，當(dāng)壓力大于35 MPa時(shí)，雖然隨著壓力的增大，提取率也在增高，但壓力的增加對(duì)產(chǎn)率增加的影響較小，由于壓力過高，不利于超臨界機(jī)器維護(hù)，綜合考慮，選取萃取壓力為35 MPa。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄籽原花青素提取工藝根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、提取時(shí)間和料液比這3個(gè)因素，分別以A、B和C代表，每一個(gè)自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，如表1所示，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。方差分析顯示：F模型=37.37，P模型<0.000 1；FA=10.21，PA=0.015 2；FB=26.46，PB=0.001 3；FC=7.87，PC=0.263；FAB=19.74，PAB=0.003；FAC=19.93，PAC=0.002 9；FBC=29.68，PBC=0.001；FA2=13.77，PA2=0.007 5；FB2=139.64，PB2<0.000 1；FC2=50.62,PC2=0.000 2;F失擬=1.57,P失擬=0.328 4?？梢钥闯?，失擬項(xiàng)中P>0.1影響不顯著，表明所選模型適合，可以用該模型來擬合試驗(yàn)。此外，提取時(shí)間對(duì)原花青素提取率影響極為顯著；乙醇濃度對(duì)原花青素提取率影響顯著。交互項(xiàng)中乙醇濃度和提取時(shí)間、乙醇濃度和料液比、提取時(shí)間和料液比對(duì)原花青素得率影響極為顯著。二次項(xiàng)中提取時(shí)間、料液比對(duì)原花青素得率影響極為顯著；乙醇濃度對(duì)原花青素得率影響顯著。

各因素經(jīng)回歸擬合后，得到原花青素提取率對(duì)乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比的二次多項(xiàng)式回歸方程為：原花青素產(chǎn)率=16.35-0.52A+0.84B+0.46C+1.03AB+1.03AC+1.26BC-0.84A2-2.66B2-1.60C2。

表1 試驗(yàn)因素水平編碼

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)回歸方程作出相應(yīng)的曲面和等高線圖，如圖7～9所示。從圖7可知，當(dāng)乙醇濃度在66%～74%，提取時(shí)間在55～65 min時(shí)，提取率應(yīng)有最高值。由圖8可知，乙醇在65%～75%時(shí)，料液比對(duì)原花青素的提取率的影響較明顯，隨著料液比中溶劑的增加有所增加，但一定時(shí)間過后提取率也有所下降，料液比在1∶1.1～1∶1.3 g/ml時(shí)提取率應(yīng)有最高值。由圖9可知，在一定范圍內(nèi)原花青素的提取率與提取時(shí)間、料液比呈正相關(guān)。當(dāng)提取時(shí)間在57～65 min，料液比1∶1.1～1∶1.2 g/ml時(shí)原花青素的提取率最高。

3 結(jié)論

該研究以新疆石河子釀酒葡萄籽為原料提取原花青素，以葡萄籽原花青素提取率為量化指標(biāo)，用單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)進(jìn)行研究，用響應(yīng)面法確定葡萄籽中原花青素提取的最佳工

藝參數(shù)，試驗(yàn)取得了較好的結(jié)果。確定了葡萄籽中原花青素提取的最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù) 69.22%，CO25 L/h，提取時(shí)間62.82 min，料液比1∶1.13 g/ml，提取溫度55 ℃，提取壓力35 MPa。此條件下葡萄籽中原花青素產(chǎn)率理論值為164.916 mg/kg，實(shí)測值為(163.60±0.93)mg/kg，原花青素純度為88.5%。

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Optimization of Process for Supercritical CO2Extraction of Grape Seed Proanthocyanidins Using Response Surface Methodology

LIU Wen-yu1, YAN Xue-qin1, LIN Xiang-qun1, WEI Chang-qing2*

(1. Xinjiang Shihezi Vocational Technical College, Shihezi, Xinjiang 832000; 2. Food College, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832000)

[Objective] With ethanol as extraction solvent, supercritical CO2extraction of grape seed proanthocyanidins was studied. [Method] Taking single factor test combined with response surface method, the extraction technique for proanthocyanidins from grape seed was optimized. [Result] The optimal conditions were obtained as follows: ethanol volume fraction 69.22%, CO25 L/h, extraction time 62.82 min, solid-liquid ratio 1∶1.13 g/ml, extraction temperature 55 ℃, extraction pressure 35 MPa. Under the above conditions, the theoretical value of proanthocyanidins in grape seed is 164.916 mg/kg, the measured value is(163.60±0.93)mg/kg, the purity of proanthocyanidins is 88.5%. [Conclusion] The study can provide reference and theoretical guidance for promoting comprehensive utilization of grape resource in Xinjiang.

Grape seed; Proanthocyanidins; Supercritical extraction; Response surface method

兵團(tuán)青年科技創(chuàng)新資金專項(xiàng)(2013CB001)。

劉文玉(1979- )，女，甘肅臨洮人，講師，從事食品科學(xué)與工程的教學(xué)和科研工作。*通訊作者，副教授，從事農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏的教學(xué)和科研工作。

2015-02-06

S 509.9

A

0517-6611(2015)09-292-03