喬秀麗，遲彩霞

(綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化 152061)

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土壤中固氮菌對農(nóng)藥抗性的研究

喬秀麗，遲彩霞

(綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化 152061)

[目的]了解自生固氮菌對不同農(nóng)藥的抗性。[方法]根據(jù)固氮菌自身的特點，應(yīng)用無氮培養(yǎng)基分離自生固氮菌獲得純種的自生固氮菌；通過抑菌圈試驗及分光光度計測定其吸光值研究了草甘膦異丙胺鹽、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、咪錳·多菌靈3種常用農(nóng)藥對自生固氮菌生長的影響。[結(jié)果]草甘膦異丙胺鹽對自生固氮菌生長有促進作用；甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽對自生固氮菌有較小的抑制作用，并且該農(nóng)藥自身不穩(wěn)定，易被分解；咪錳·多菌靈對固氮菌有強烈抑制作用。[結(jié)論]試驗結(jié)果為田間正確使用農(nóng)藥提供了理論依據(jù)。

自生固氮菌；抑菌圈；農(nóng)藥；抗性

自20世紀90年代以后，農(nóng)業(yè)高產(chǎn)主要依靠大量使用農(nóng)藥、化肥，致使我國成為世界污染大國。農(nóng)藥的使用致使土壤中的固氮菌生長受到抑制，造成土壤肥力下降，使得人們不得不繼續(xù)增加化肥的使用量來提高農(nóng)作物產(chǎn)量，惡性循環(huán)使綠色食品離人們越來越遠。應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，建立和完善生物固氮體系已經(jīng)成為解決人類目前所面臨的人口、糧食、能源和環(huán)境等問題的重要措施[1-6]。

固氮菌在自然界分布十分廣泛，可以固定空氣中的游離氮轉(zhuǎn)變?yōu)樯锟梢岳玫牡豙7-10]。固氮反應(yīng)是地球上維持生產(chǎn)的一個重要的生態(tài)反應(yīng)。研究固氮菌對農(nóng)藥是否有一定的抗藥性(耐藥性)及農(nóng)藥對自生固氮菌是否有影響，已是迫在眉睫的問題[11-16]。為此，筆者將不同地點的土樣在無氮培養(yǎng)基上進行分離和純化，同時采用抑菌圈法和分光光度計測吸光值的方法，檢測了常用的不同種類田間農(nóng)藥對自生固氮菌生長的影響及自生固氮菌對農(nóng)藥的抗性，以期為田間正確使用農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑與藥劑。95%乙醇、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氯化鈉、碳酸鈣、瓊脂粉、結(jié)晶紫、碘、碘化鉀、番紅均為分析純；草甘膦異丙胺鹽水劑(上?；莨猸h(huán)境科技有限公司)、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽乳油(湖北巨勝科技有限公司)、咪錳·多菌靈可濕性粉劑(吉林長春長雙農(nóng)藥有限公司)。

1.1.2儀器。XSP-BM-8C型顯微鏡(上海上光儀器有限公司)、HPX-9162 MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱(上海波徐實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、SW-CJ-2F超雙人雙面凈化工作臺(江蘇蘇州凈化設(shè)備有限公司)、BL-50A立式壓力滅菌器(上海東亞壓力容器制造有限公司)、752型紫外-可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1培養(yǎng)基的配制與自生固氮菌的分離純化。

1.2.1.1培養(yǎng)基的配制。無氮固體培養(yǎng)基：葡萄糖15.0 g，硫酸鎂0.3 g，磷酸二氫鉀0.3 g，硫酸鈣0.3 g，氯化鈉0.2 g，碳酸鈣7.5 g，瓊脂粉3.0 g，無菌水150 ml，調(diào)節(jié)pH至6.5～7.0，滅菌備用[17-18]。使用時加入相應(yīng)濃度的農(nóng)藥。液體培養(yǎng)基：上述配方不加瓊脂粉。上述成分在0.1 MPa、121 ℃下滅菌20 min，冷卻后再加葡萄糖。

1.2.1.2土壤采集及處理。在樹林中鏟去表面2 cm表面土，取5～10 cm深層土壤，裝入滅過菌的燒杯中，密封保存，采取多點取樣，標(biāo)記取樣地點、時間、環(huán)境。將土樣于4～5 ℃冰箱中保存。

試驗時將土樣混合均勻，放于28 ℃恒溫箱中烘干水分，然后放于紗布中進行過篩。去除土塊以及雜物，留下粉狀土樣。

1.2.1.3固氮菌的分離和純化。將滅過菌的無氮培養(yǎng)基融化，冷卻到50 ℃，倒入無菌培養(yǎng)皿中，凝固后制成平板。將準(zhǔn)備好的土樣(與無菌水配制成泥漿狀)劃線接種到制備好的平板中，標(biāo)明樣號、日期。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、觀察。當(dāng)接種部位長出透明、膠狀菌落時，進行純化，直至出現(xiàn)單菌落為止[19]。

1.2.1.4自生固氮菌革蘭氏染色鏡檢。取對數(shù)生長期的菌落進行革蘭氏染色[20]，油鏡觀察染色結(jié)果，并用已知菌作對照。

1.2.2農(nóng)藥對自生固氮菌生長的影響。

1.2.2.1自生固氮菌最大吸收波長的測定。用接種環(huán)將純化的自生固氮菌接種于配制好的液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h。用紫外-可見分光光度計測其不同濃度的OD值，確定最大吸收波長為600 nm。

1.2.2.2抑菌圈試驗。取對數(shù)期液體菌種，在預(yù)先制作好的固體培養(yǎng)基上進行涂布接種。將直徑為1 cm的無菌濾紙浸泡于不同種類的農(nóng)藥中，浸泡無菌水的濾紙片作為空白對照，烘干后放于涂布好的平板中，28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察記錄抑菌圈大小。

1.2.2.3測定3種不同農(nóng)藥對所分離固氮菌生長的影響。取處于對數(shù)生長期的液體自生固氮菌菌種1 ml，加入到液體無氮培養(yǎng)基中，分別加入1 ml農(nóng)藥(農(nóng)藥的濃度達到田間施用濃度)，以不加入農(nóng)藥的液體無氮培養(yǎng)基作為空白對照，分別測0、4、6、8、24 h自生固氮菌的OD600 nm并做記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)與革蘭氏染色觀察

2.1.1菌落形態(tài)觀察。單個菌落圓形或橢圓形，中間凸起，呈煎蛋狀、透明或半透明、乳白色或者乳黃色，表面光滑、濕潤、有光澤，有一定黏度，培養(yǎng)48 h后單個菌落直徑為1～2 mm，約為小米粒大小。

2.1.2革蘭氏染色觀察。試驗所獲得的自生固氮菌，革蘭氏染色為陰性，在顯微鏡下觀察為卵形、橄欖球狀或桿狀，單生或雙生(多呈“8”型雙生結(jié)構(gòu))，有時呈不規(guī)則堆狀(圖1)。

2.2 抑菌圈試驗結(jié)果由表1可知，草甘膦異丙胺鹽沒有抑菌圈，對自生固氮菌無抑制作用，與空白對照完全相同；而咪錳·多菌靈的抑菌圈直徑為13 mm，對固氮菌有較大抑制作用。甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的抑菌圈直徑為1 mm，只有在較高濃度時才對自生固氮菌有一定的抑制作用。

表1 各種農(nóng)藥抑菌圈大小

2.3 3種不同農(nóng)藥對所分離固氮菌生長的影響由圖2可知，在24 h內(nèi)培養(yǎng)液中含咪錳·多菌靈的菌體吸光值逐漸下降，由0.061下降到-0.034，說明該藥對自生固氮菌有一定的抑制作用。培養(yǎng)液中含有草甘膦異丙胺鹽的菌體吸光值在4～6 h內(nèi)下降，8～24 h內(nèi)有所升高，但都高于對照組，說明該藥對所分離自生固氮菌沒有抑制作用，反而有一定的促進作用。這是因為該藥為氨基酸類農(nóng)藥，自身吸光值較高；再者它本身可以作為自生固氮菌營養(yǎng)成分的一種，自生固氮菌可以從培養(yǎng)基中直接攝取。培養(yǎng)液中含有甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的菌株吸光值與對照相比略有降低，總體處于上升趨勢。原因是甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽自身不穩(wěn)定，自生固氮菌將其分解后，對自生固氮菌無抑制作用；再有甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽是一種高效、廣譜的殺蟲劑，并不是專一殺菌劑，自生固氮菌易對該類藥物產(chǎn)生抗藥性。

3 結(jié)論

通過抑菌圈試驗及分光光度計測定其吸光值檢測草甘膦異丙胺鹽、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、咪錳·多菌靈3種常用農(nóng)藥對自生固氮菌生長的影響。結(jié)果表明，自生固氮菌對不同農(nóng)藥有一定抗性。具體為：草甘膦異丙胺鹽對自生固氮菌無抑制作用，反而有一定的促進作用；甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽對自生固氮菌有一定的抑制作用，但是抑制作用較小，并且自身不穩(wěn)定，可以被自生固氮菌分解，所以自生固氮菌對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽有一定的抗藥性；咪錳·多菌靈對自生固氮菌有強烈的抑制作用，自生固氮菌對該類農(nóng)藥無抗藥性。

試驗僅限于自生固氮菌對農(nóng)藥抗性的研究，其他固氮菌未涉及到，今后將對其他固氮菌進行深入研究，以完善相關(guān)資料，為我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展提供一定的理論依據(jù)。

[1] 胡蓉，邱道持.我國耕地保護形勢與應(yīng)對策略[J].城市問題，2008(12)：5-13.

[2] 陸忠，李明輝，鄧俊柏，等.固氮菌肥對甘蔗增產(chǎn)效應(yīng)試驗小結(jié)[J].廣西蔗糖，2003，31(2)：6-7.

[3] 黃杏，楊麗濤，李楊瑞.固氮菌接種對甘蔗根系生理特性的影響[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，40(3)：233-237.

[4] 夏覓真，馬忠友，曹媛媛，等.棉花根際固氮菌、解磷菌及解鉀菌的相互作用[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2010，22(2)：102-105.

[5] 陳河龍，李慶洋，易克賢，等.劍麻根際聯(lián)合固氮菌的分離及固氮活性測定[J].熱帶作物學(xué)報，2011，32(6)：1097-1101.

[6] 王曉輝，姜虎，刁槕，等.固氮菌的篩選及其對菜場垃圾堆肥化的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，43(11)：77-80.

[7] 盧秉林，王文麗，李娟，等.自生固氮菌的固氮能力及其對春小麥生長發(fā)育的影響[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，17(5)：895-899.

[8] 欒敏.土壤自生固氮菌的分離鑒定及生物固氮與促進植物生長效應(yīng)研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[9] 蒲一濤，鐘毅滬.固氮菌和纖維素分解菌對固氮的影響[J].深圳大學(xué)學(xué)報：理工版，1999，16(4)：61-64.

[10] 劉昔輝.甘蔗內(nèi)生固氮菌的分離鑒定與不同氮水平對其固氮的影響[D].南寧：廣西大學(xué)，2008.

[11] 劉輝利，佟小薇，朱義年，等.土壤固氮吸附試驗研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(4)：1556-1558，1598.

[12] KETCHUM P A.Microbiology：Concepts and Applications [M].New York：John Wiley & Sons，2009：62-63.

[13] 羅霆，歐陽雪慶，麗濤，等.15N同位素稀釋法研究固氮菌接種對甘蔗生物固氮的影響[J].核農(nóng)學(xué)報，2010，24(5)：1026-1031.

[14] 黃慧岳，謝達平.自生固氮菌的篩選及其在滅菌土壤中的生長特性[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(11)：20-22.

[15] 申進玲，陳蕾，李曉蕙，等.固氮菌及其共生體系修復(fù)土壤重金屬污染[J].中國農(nóng)村小康科技，2006(6)：68-69.

[16] 周新文.化學(xué)農(nóng)藥對土壤微生物的影響[J].上海環(huán)境科學(xué)，1997，16(2)：34-37.

[17] 劉樸方.農(nóng)肥和化肥施用對大豆根瘤菌和土壤固氮菌多樣性的影響[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[18] 周德慶.微生物學(xué)教程 [M].北京：高等教育出版社，2010：1-5，133-138，150-152.

[19] 沈萍.微生物學(xué) [M].北京：高等教育出版社，2000：8.

[20] 陳晶，楊海凌，陳向東.自生固氮菌的生態(tài)分布及其對農(nóng)藥的抗性的研究[J].氨基酸和生物資源，2009(1)：19-24.

Research on Pesticide Resistance ofAzotobacterin the Soil

QIAO Xiu-li, CHI Cai-xia

(Food and Pharmaceutical Engineering College, Suihua University, Suihua，Heilongjiang 152061)

[Objective] The aim was to understand pesticide resistance ofAzotobacterin the soil. [Method] The pure abiogenousAzotobacterwas isolated through using nitrogen-free medium according to the characteristics ofAzotobacter. The effect of three commonly used pesticides such as Glyphosate isopropylamine salt, Emamectin benzoate and Carbendazim on abiogenousAzotobactergrowth were tested through the inhibition zone andODmeasured by spectrophotometer. [Result] The Glyphosate isopropylamine salt had a promoting effect on abiogenousAzotobactergrowth; Emamectin benzoate had little inhibitory effect, and the pesticide itself was not stable, easy to be broken down; Carbendazim had strong inhibitory effects onAzotobactergrowth. [Conclusion] The results provide theoretical basis for the correct use of pesticides in field.

AbiogenousAzotobacter; Inhibition zone; Pesticide; Resistance

黑龍江省科技特派員農(nóng)村科技創(chuàng)業(yè)項目(111)；綏化學(xué)院新農(nóng)村建設(shè)研究項目(SXK120101)。

喬秀麗(1963- )，女，黑龍江綏化人，教授，從事農(nóng)副產(chǎn)品利用及檢測研究。

2015-02-11

S 474+.3

A

0517-6611(2015)09-129-02