胡發(fā)遠，趙玉勤，王 斌

(浙江海洋學院食品與醫(yī)藥學院，浙江舟山 316022)

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響應面法優(yōu)化孔鰩軟骨抗氧化多肽的酶解工藝

胡發(fā)遠，趙玉勤*，王 斌

(浙江海洋學院食品與醫(yī)藥學院，浙江舟山 316022)

[目的] 探討酶解法制備孔鰩魚軟骨抗氧化肽的最佳工藝。[方法] 以孔鰩軟骨為試驗材料，以DPPH自由基清除率為考察指標，采用雙酶復合法酶解制備抗氧化多肽，通過響應面分析優(yōu)化為最佳酶解工藝參數。[結果] 采用胰蛋白酶與堿性蛋白酶復配(1∶3)組合制備酶解物的抗氧化性最好，酶解的最優(yōu)工藝條件為：pH 8.5，加酶量6.25%，料液比2.1%，溫度50.19 ℃，預測的DPPH自由基清除率為34.45%。[結論] 通過響應面設計優(yōu)化確定了孔鰩軟骨抗氧化多肽的酶解工藝，為軟骨魚類高值化利用提供技術支持。

孔鰩軟骨；響應面分析；酶解；多肽；抗氧化活性

近年來，酶制劑產業(yè)與酶工程技術得到了較快發(fā)展，也引起了醫(yī)藥產業(yè)的重大變革，而以酶工程技術降解蛋白質制備活性多肽更受到了廣泛重視。由于海洋生態(tài)環(huán)境與陸地生態(tài)環(huán)境的的巨大差異，導致了海洋生物體內蛋白質與陸地生物蛋白有較大差異，包含有許多具有顯著生物活性的多肽序列。因此，借助酶工程技術對海洋生物蛋白進行酶解，將開發(fā)出新穎高效且與陸源蛋白不同的的生物活性肽。

軟骨魚是地球上僅存最古老的有頜脊椎動物，我國有13目40科90屬約202種，主要包括鯊魚、魟魚、鰩和銀鮫，是海洋生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分之一[1]。近年來，一些研究表明軟骨魚軟骨中富含多種活性因子，入血管生成抑制因子、抗腫瘤因子和抗氧化因子等[2-7]?？做?Rajaprosa)，又稱為“老板魚”、“勞板魚”、“華子魚”、“甫魚”、“水魚”等，隸屬脊索動物門、鰩科，我國分布于黃海、渤海、東海，為重要的漁業(yè)捕撈對象[8-9]。但是，目前尚未有關于孔鰩軟骨多肽酶解工藝的研究?；诖耍P者以孔鰩軟骨為材料，進行響應面法優(yōu)化孔鰩軟骨抗氧化多肽的酶解工藝研究，以期為軟骨魚類軟骨的高值化利用提供一條新的途徑，也為軟骨蛋白多肽抗氧化藥物的篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料孔鰩(Rajaporosa)購自舟山市南珍市場；鹽酸胍、2-N-嗎啡乙磺酸MES、乙二胺基四乙酸鈉、EDTA、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，均購自美國Amresco公司；蛋白酶均由亞泰恒信生物技術公司生產；DEAE-52、SephadexG-25，均為上海源聚生物工程有限公司生產；試驗用水為超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1DPPH自由基清除能力的測定。參照Bersuder等[10]的方法測定DPPH自由基清除能力。取試驗酶解物與無水乙醇各1 ml混勻，加入125 μl由無水乙醇配制的0.02%濃度的DPPH溶液，用雙蒸水替代酶解物作為對照，以無水乙醇替代DPPH作為空白。將混合物避光常溫放置6 min，于波長517 nm處測定吸光值。自由基清除率按照以下公式計算：

DPPH清除率=(OD0+ODb-ODs)/OD0×100%

式中，ODs為樣品組吸光度；ODb為空白組吸光度；OD0為對照組吸光度。

1.2.2孔鰩軟骨蛋白的提取[11-12]。稱取孔鰩軟骨500 g，切成小碎塊，加入適量蒸餾水，在高速組織搗碎機中勻漿至糊狀并浸于3倍體積的1.0 mol/L鹽酸胍溶液中(含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH 6.5)，于4 ℃下攪拌抽提48 h。低溫高速離心所得的上清液用0.22 μm微孔濾膜除去不溶性雜質，即為孔鰩軟骨蛋白粗提液。然后，向上清液中加入中濃度為30%預冷丙酮，于4 ℃下靜置4 h，低溫高速離心得到30%孔鰩軟骨丙酮沉淀蛋白；繼續(xù)加入預冷丙酮至其濃度為60%，4 ℃下靜置4 h，12 000 r/min低溫離心25 min得到孔鰩軟骨60%丙酮沉淀蛋白，冷凍干燥后稱重備用，計算得率[13]。

1.2.3酶解工藝的優(yōu)化。以5種蛋白酶胃蛋白酶(Pepsin)、胰蛋白酶(Trypsin)、木瓜蛋白酶(Papain)、中性蛋白酶(Neutral protease)和堿性蛋白酶(Alkali protease)在各自最適水解條件下酶解軟骨蛋白。以篩選20 mg/ml酶解物DPPH自由基清除活性最好的2種酶進行復配酶解試驗，并確定2種酶的最適比例。根據響應模型試驗設計原理，選定pH(X1)、溫度(X2)、料液比(X3)、加酶量(X4)4個對2 mg/ml酶解物響應值DPPH自由基清除率(Y)影響顯著的主要因素，采用二次回歸中心組合試驗設計4因素3水平的試驗設計優(yōu)化酶解工藝[14]。采用Design Expert 8.0.5分析軟件對酶解工藝進行數據處理。響應面試驗因素水平設計見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 孔鰩軟骨蛋白粗提物的制備孔鰩軟骨組織勻漿液經鹽酸胍抽提、丙酮分級沉淀，得到30%丙酮沉淀蛋白3.56 g，得率為0.63%；60%丙酮沉淀蛋白5.83 g，得率為0.78%。分別檢測30%丙酮沉淀蛋白組分和60%丙酮沉淀蛋白組分的DPPH自由基清除率。由表2可知，孔鰩軟骨60%丙酮沉淀蛋白組分抗氧化能力較30%丙酮沉淀蛋白組分強，因此選擇孔鰩軟骨60%丙酮沉淀蛋白組分進行下一步的酶解。

表2 孔鰩軟骨丙酮沉淀蛋白及其酶解物的DPPH自由基清除活性(20 mg/ml)

丙酮沉淀蛋白及其酶解物DPPH自由基清除率∥%丙酮沉淀蛋白及其酶解物DPPH自由基清除率∥%30%丙酮沉淀蛋白11.60±0.38木瓜蛋白酶酶解物(3)40.32±2.0160%丙酮沉淀蛋白17.10±2.14中性蛋白酶酶解物(4)48.23±2.69胃蛋白酶酶解物(1)27.39±1.06堿性蛋白酶酶解物(5)34.20±1.56胰蛋白酶酶解物(2)51.62±2.97胰/堿(1∶3)雙酶酶解物(6)57.43±3.25

2.2 最適蛋白酶的選擇由表1和圖1可知，在酶解物的濃度為20 mg/ml條件下，雙酶復合體系——胰蛋白酶/堿性蛋白酶(1∶3)的酶解產物具有更強的抗氧化能力，DPPH自由基清除率達到(57.43±3.25)%。據報道，復合蛋白酶同時作用于底物時，相對單酶酶解體系而言，通常具有協(xié)同增效作用[15]，酶解效率更高，酶解物的水解度更大。因此，該試驗中采用雙酶酶解法制備孔鰩軟骨抗氧化多肽的活性高于單酶酶解物。基于此，后續(xù)試驗選用雙酶復合體系-胰蛋白酶/堿性蛋白酶(1∶3)酶解制備軟骨多肽。

表3 Box-Behnken設計及試驗結果

根據二次回歸方程所得響應曲面圖(圖2)，用于分析pH、加酶量、料液比及溫度對水解度的影響情況。交互項作用不明顯的均未列出。從圖2可以看出，加酶量和溫度對清除DPPH自由基活性的影響極為顯著，清除率隨料液比增加而增加，當料液比低于1∶2.3時其改變對水解度影響較大(曲面弧度較大)，當料液比高于1∶2.3時其改變對水解度影響較小(曲面弧度較小)；pH與溫度、pH與加酶量對軟骨蛋白酶解物清除DPPH自由基能力的影響也達到顯著水平，隨著溫度、加酶量的升高，軟骨蛋白水解物對自由基的清除率均呈現先升后降的變化趨勢。對酶解的影響效果與方差分析的結果一致：pH >加酶量>料液比>溫度。

表4 二次回歸方程模型的方差分析結果

注：*表示差異顯著(P< 0.05)；**表示差異極顯著(P< 0.01)。

2.5 蛋白酶解工藝條件的確定及驗證對所得方程進行逐步回歸，可得到酶解的最優(yōu)工藝條件：pH 8.5，加酶量6.25%，料液比為2.1%，溫度為50.19 ℃，預測酶解物濃度在2 mg/ml時DPPH自由基清除率為34.45%?？紤]到操作的可行性，實際酶解條件修正為：pH 8.5，加酶量6.2%，料液比為2%，溫度為50 ℃。在此優(yōu)化條件下進行驗證試驗，3次平行樣的平均DPPH清除率為(34.87±0.52)%，與預測值較為接近，證明該模型能較好地預測孔鰩軟骨酶解液的實際DPPH 自由基清除效果。

3 小結

該試驗以生物活性顯著的孔鰩軟骨蛋白為原料，利用復合酶解的方法制備軟骨蛋白多肽，采用響應面設計優(yōu)化試驗參數，最終優(yōu)化得到最佳的酶解工藝條件為：pH 8.5，加酶量6.25%，料液比為2.13%，溫度為50.19 ℃，根據試驗方程預測軟骨蛋白水解物濃度為2 mg/ml時DPPH自由基清除率為34.45%。通過模型方差分析表明，各考察因素對DPPH自由基清除率的影響明顯不同，大小順序依次為 pH>加酶量>料液>溫度。響應面分析結果真實可靠，可以為酶解工藝條件的篩選提供依據。該研究為孔鰩軟骨多肽的酶解制備工藝提供理論依據，也為軟骨魚類的高值化利用提供了一種新思路。

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Optimization of the Hydrolysis Conditions of Antioxidant Peptides from Cartilages ofRajaporosaby Response Surface Methodology

HU Fa-yuan, ZHAO Yu-qin*, WANG Bin

(School of Food and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan, Zhejiang 316022)

[Objective] To determine the optimal parameters on preparation the antioxidant peptides ofRajaporosacartilages by response surface methodology(RSM). [Method] With the DPPH radical scavenging activity as index, the enzymatic parameters of antioxidant hydrolysate from cartilage proteins ofR.porosawere optimized by the RSM. [Result] The results showed that the optimum enzymolysis conditions were as follows: pH 8.5, enzyme to substrate ratio 6.25%, material to liquid ratio 2.1%, and temperature 50.19 ℃. [Conclusion] The optimal parameters on preparation the antioxidant hydrolysate from cartilage proteins ofR.porosawere determined by RSM, which will provide technical support for the high value usage of cartilage fish.

Rajaporosacartilage; Response surface analysis; Enzymatic hydrolysis; Polypeptide; Antioxidant activity

浙江省科技廳公益信息技術研究社會發(fā)展項目(2014C33034)；浙江省科技廳重大科技專項重大社會發(fā)展項目(2011C02003)。

胡發(fā)遠(1989- )，女，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：海洋生物資源綜合利用。*通訊作者，講師，從事海洋活性物質藥理學研究。

2015-01-31

S 917

A

0517-6611(2015)09-107-03