康宏玲，王志強，劉曉輝

(1.沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧撫順 113122；2.撫順市消防支隊清原縣消防大隊，遼寧撫順 113300；3.山東安池農(nóng)牧科技有限公司，山東濟南 250220)

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HPLC法同時測定四神片中兩種木脂素類化合物的含量

康宏玲1，王志強2，劉曉輝3

(1.沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧撫順 113122；2.撫順市消防支隊清原縣消防大隊，遼寧撫順 113300；3.山東安池農(nóng)牧科技有限公司，山東濟南 250220)

[目的]建立了高效液相色譜法同時測定四神片中2種木脂素類化合物含量的分析方法。[方法]采用迪馬公司Diamonsil(鉆石)C18柱，以乙腈∶水=75∶25(v/v)為流動相，柱溫25 ℃，進樣量10 μl，流速0.8 ml/min，DAD程序檢測，檢測波長216 nm。[結(jié)果]2種木脂素類化合物五味子甲素和五味子乙素在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 6、0.999 8，平均回收率分別為94.50%、96.61%，RSD分別為1.9%、2.0%。[結(jié)論]該方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確，實現(xiàn)了對四神片中2種木脂素類化合物的同時測定。

高效液相色譜法；四神片；木脂素；含量

四神片是現(xiàn)今臨床常用方劑，其味酸、辛，能助腎散寒，止瀉消脹，主要用于腎虛受寒、腸鳴肚脹、五更溏瀉、食物不化、久瀉不止、面黃體弱[1]，其主要成分為肉豆蔻(制)、吳茱萸、補骨脂、五味子、干姜、大棗(去核)。方藥五味子中的木脂素類化合物具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效[2]。筆者采用RP-HPLC法同時測定四神片中五味子甲素和五味子乙素2種木脂素類化合物的含量，以便對其片劑質(zhì)量進行更好的監(jiān)管，為四神片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供更好的方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器Agilent HP1100高效液相色譜儀(配有四元梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器)；超純水發(fā)生系統(tǒng)(MILLIPORE公司)； CX-300W超聲波清洗機(北京市醫(yī)療設(shè)備二廠)； LG10-2.4A型高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；ES-120型電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司)；一次性使用無菌注射器(上海凱樂輸液器廠)；Ф13 mm 0.22 μm一次性微孔樣品過濾膜(希波氏)等。

1.2 試藥四神片(沈陽雙鼎制藥有限公司)；乙腈，色譜純(Fisher Chemicals公司)；甲醇，色譜純(Fisher Chemicals公司)；五味子甲素和五味子乙素，均為化學(xué)對照品(中國藥品生物制品檢定所)；無水乙醇，分析純(安徽安特生物化學(xué)有限公司)；正己烷，分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

1.3 試驗方法

1.3.1對照品溶液的制備。準(zhǔn)確稱取五味子甲素和五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品各0.010 0 g，加入乙腈溶解并定容于10 ml容量瓶中，混勻，配制成1 000 μg/ml混合對照品儲備液，備用[3]。

1.3.2供試品溶液的制備。取四神片10片，研細(xì)，精密稱取2.000 0 g，加入10 ml 80%乙醇溶液于比色管中，超聲提取3次，每次超聲時間為30 min，冷卻后用80%乙醇溶液定容于50 ml容量瓶中，混勻，離心分離取上層清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后待測。

1.3.3色譜條件。色譜柱為Diamonsil(鉆石)C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬公司)，流動相為乙腈和水，流動相配比為乙腈∶水=75∶25 (v/v)，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μl，流速為0.8 ml/min；DAD檢測器，檢測波長為216 nm。

1.3.4方法學(xué)考察。

1.3.4.1系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μl，按“1.3.3”的色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.3.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別精密吸取“1.3.1”項下的混合對照品儲備液0.01、0.04、0.10、0.50、1.00、2.00 ml于10 ml容量瓶中，用乙腈定容配置成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，取各標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣分析，以進樣濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.3精密度試驗。精密吸取10 μl混合對照品溶液(1.00 μg/ml)連續(xù)進樣10次，測定峰面積值，計算其RSD值。

1.3.4.4穩(wěn)定性試驗。精密吸取供試品溶液10 μl在0、4、8、12、16、20、24 h分別進樣分析，測定峰面積并計算RSD值。

1.3.4.5重復(fù)性試驗。取同批供試品試樣10份，按“1.3.2”方法平行制備供試品溶液，進樣分析，測定峰面積的RSD值。

1.3.4.6回收率試驗。取同批供試品試樣6份(五味子甲素和五味子乙素的含量分別為164.8和210.3 μg/g)，每份精密稱取2.0 g左右并加入200 μg/ml混合對照品溶液2.00 ml，按“1.3.2”方法制備供試品溶液，進樣分析，測定五味子甲素和五味子乙素的平均含量、回收率及RSD值。

1.3.5樣品含量測定。在“1.3.3”的色譜條件下，取5批供試品樣品，按“1.3.2”方法制備供試品溶液進樣分析，分別計算五味子甲素和五味子乙素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。從圖1a可以看出，五味子甲素和五味子乙素的保留時間分別是14.7和18.3 min，分離效果很好；在樣品圖(圖1b)中也在同一時間出現(xiàn)了相應(yīng)的色譜峰，且樣品中其他干擾峰沒有影響分離效果，經(jīng)計算分離度均大于1.5，滿足分析的要求。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得五味子甲素的回歸方程為Y=79.625X-2.021，相關(guān)系數(shù)為0.999 6；五味子乙素的回歸方程為Y=77.462X-5.205，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。結(jié)果表明，五味子甲素和五味子乙素在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3精密度試驗。取1.00 μg/ml混合對照品溶液連續(xù)進樣10次，經(jīng)計算五味子甲素和五味子乙素峰面積的RSD值分別為0.7%和0.8%，表明該試驗所用儀器的精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗。對供試品溶液在1 d內(nèi)的進樣分析得出五味子甲素和五味子乙素峰面積的RSD值分別為1.2%和1.8%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5重復(fù)性試驗。取同批次供試品10份，進行平行測定，得出五味子甲素和五味子乙素峰面積的RSD值分別為2.4%和2.1%，表明該試驗重復(fù)性良好。

2.1.6回收率試驗。從表1可以看出，五味子甲素和五味子乙素2種化合物的平均回收率分別為94.50%和96.61%，RSD值分別為1.9%和2.0%，表明該方法回收率良好、準(zhǔn)確度高。

表1 樣品中五味子甲素和五味子乙素的加標(biāo)回收率

2.2 樣品含量測定在最佳的試驗條件下，5批樣品中五味子甲素的含量分別為164.8、164.9、164.2、165.3、162.6 μg/g，五味子乙素的含量分別為210.3、211.4、210.5、210.1、209.4 μg/g(n=3)。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

3.1.1分析方法的選擇。根據(jù)相關(guān)文獻的報道，木脂素類化合物的分析方法主要有分光光度法、薄層色譜掃描法、毛細(xì)管電色譜法、高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法等，近年來應(yīng)用比較廣泛的是高效液相色譜法，從分析成本上看高效液相色譜儀比液質(zhì)聯(lián)用儀更為便宜且分析效能高、選擇性好、分析速度快、靈敏度高，為此試驗選擇采用高效液相色譜法。

3.1.2色譜條件的考察。

3.1.2.1流動相及配比的選擇。該試驗曾以甲醇-水為流動相，結(jié)果2種化合物出峰時間大大延長，且色譜峰明顯變寬，從樣品的色譜分離圖也能看出，2種化合物與其他物質(zhì)分離效果不好，有包峰現(xiàn)象，為此試驗選擇乙腈-水為流動相，乙腈溶劑強度大、粘度小，使五味子甲素和五味子乙素的洗脫和分離效果更好，為了使保留時間縮短，綜合考慮分離度和測定時間該試驗選擇乙腈∶水=75∶25的流動相配比。

3.1.2.2檢測波長的選擇。該試驗采用DAD檢測器，此檢測器可對被測物質(zhì)的紫氣-可見吸收光譜圖進行快速的動態(tài)掃描，可以直接得到每種組分的最大吸收波長，而組分以最大吸收波長作為檢測波長能減小基線漂移，可以大大提高檢測的靈敏度，通過對組分進行紫外光譜掃描可知2種組分均在216 nm處有最大吸收峰，所以試驗選擇216 nm為最佳檢測波長。

3.1.3樣品前處理方法的選擇。通過正交試驗，試驗考察了不同的提取方法(冷浸提取法、超聲提取法、回流提取法)、提取試劑(正己烷、乙腈、乙醇、80%乙醇、60%乙醇)、提取次數(shù)(1、2、3次)和提取時間(20、30、40、60 min)的影響，結(jié)果表明采用80%的乙醇溶液超聲提取3次，每次提取時間30 min為最佳。

3.2 結(jié)論在上述確定的試驗條件下，2種木脂素類化合物能與樣品中其他物質(zhì)達(dá)到良好的分離，通過DAD檢測器進行定性分析，2種物質(zhì)的出峰先后順序為五味子甲素和五味子乙素，沒有包峰現(xiàn)象。試驗方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好，可以滿足日常分析的要求，可作為四神片質(zhì)量控制的常用方法。

[1] 慶俊，于金蘭，董國剛. RP-HPLC測定四神片中補骨脂素和異補骨脂素的含量[J]. 吉林醫(yī)藥醫(yī)學(xué)學(xué)報，2008，29(6)：354.

[2] 趙永德，崔惠玲，李娟. 五味子的藥理作用及臨床應(yīng)用[J]. 中華臨床醫(yī)藥與護理·藥物與臨床，2005(6)：41-43.

[3] 裴毅，聶江力. 高效液相色譜法測定五味子乙素含量[J]. 植物研究，2005，25(3)：373-375.

康宏玲(1979-)，女，遼寧大連人，講師，碩士，從事儀器分析、藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等研究。

2015-02-15

S 567

A

0517-6611(2015)09-070-02