楊艷容

(襄陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北襄陽(yáng) 441050)

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保康野生蠟梅花與葉基因組DNA提取方法的研究

楊艷容

(襄陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北襄陽(yáng) 441050)

[目的]證實(shí)從蠟梅花基因組提取DNA等同于從葉基因組提取DNA。[方法]采用CTAB法，對(duì)?？狄吧灻坊ㄅc葉基因組進(jìn)行遺傳多樣性研究。 [結(jié)果]在用CTAB法提取DNA時(shí)，65 ℃水浴振蕩并二次抽提后花基因組DNA在濃度和OD260/OD280上都與葉基因組DNA達(dá)到相近的水平。[結(jié)論]從性狀表現(xiàn)更顯著的蠟梅花基因組提取DNA進(jìn)行遺傳性分析能達(dá)到葉基因組的水平。

蠟梅；花；葉；提??；擴(kuò)增

植物ISSR分子標(biāo)記中DNA提取材料多為植物的嫩葉，關(guān)于花基因組DNA提取的方法尚未見報(bào)道。蠟梅是較特殊的材料，其冬季開花，野生種多分布于偏遠(yuǎn)山區(qū)，生境常為坡地、溝谷、 懸崖、石隙等，采集材料較為困難，且形態(tài)分類上花部特征是其分類的主要指標(biāo)，因而結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察采集蠟梅的花提取花基因組DNA并進(jìn)行遺傳多樣性分析顯得更有意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料供試蠟梅花與葉片的材料均采自?？荡虨狭謭?chǎng)，采樣時(shí)間2007年12月16日和2008年3月28日。

1.2 主要試劑CTAB提取緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl(pH 8．0)，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，3% CTAB，2% PVP，1% β-巰基乙醇)，氯仿∶異戊醇(24∶1，V/V)。

PCR試劑中的Primer、MgCl2、PCR Buffer，上海生工生物工程有限公司，dNTP、TaqDNA聚合酶，北京鼎國(guó)生物技術(shù)責(zé)任有限公司。其他藥品由上海國(guó)藥集團(tuán)提供，以上藥品均為分析純。

1.3 保存方法用剪刀剪取蠟梅的花或葉片，將花或葉片放入裝有5倍體積變色硅膠的密封袋中，室溫下保存。待硅膠變色后立即更換，直到花或葉片變脆。

1.4 基因組DNA的提取采用改良CTAB法[1]提取蠟梅基因組DNA，材料為8組對(duì)應(yīng)的蠟梅花與嫩葉。提取方法：①稱取200 mg硅膠干燥后的花瓣片或嫩葉(干樣稱50 mg)，將其放入研缽中，再加入液氮，研磨成粉末狀，然后分裝入2個(gè)2 ml的圓頭離心管中，將65 ℃預(yù)熱的CTAB提取液700 μl加入迅速混勻；②將混勻的離心管放入65 ℃水浴80 min，每隔10 min輕搖一次，取出冷卻至室溫；③將等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1，V/V)加入離心管中，將其緩慢顛倒混勻，然后抽提15 min直至溶液呈乳濁狀，12 000 r/min下離心20 min；④用剪掉端部的槍頭小心地吸取上清液，將其轉(zhuǎn)入新的1.5 ml離心管中，加入-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，輕柔顛倒使其混合均勻；⑤將混合均勻的離心管置于-20 ℃冰箱，靜置1 h后將其取出，8 000 r/min離心2 min，將上清液棄之，然后用70%無水乙醇洗滌沉淀2次，每次10 min，放置于室溫下進(jìn)行干燥；⑥加入200 μl TE溶解DNA沉淀，然后加入2 μl Rnase(10 mg/ml)，在37 ℃下保溫1 h去除RNA，5 000 r/min離心2 min，將上清液吸至新的1.5 ml離心管，去除底部未溶的沉淀。最后將上清液保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 DNA的電泳檢測(cè)及紫外吸收檢測(cè)(1)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：將待測(cè)DNA與稀釋好的作為標(biāo)準(zhǔn)用的λDNA同時(shí)在0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，然后通過0.5%EB染色，用Gel DocTM EQ凝膠成像儀系統(tǒng)在紫外光下拍照，粗略估算各樣品的DNA濃度，同時(shí)檢測(cè)總DNA分子大小以及基因組是否降解。

(2)紫外吸收檢測(cè)：將待測(cè)DNA樣品用TE緩沖液稀釋至3 ml，保證其濃度在5～50 μg/ml，將其作為待測(cè)液。以TE作為參比液調(diào)零，用Varian UV-100紫外可見光分光光度計(jì)分別測(cè)定波長(zhǎng)260 nm和280 nm的光吸收值，根據(jù)A260估算樣品DNA得率，最后根據(jù)OD260/OD280判斷DNA的大致純度[2]。

1.6 ISSR-PCR擴(kuò)增選取3組提取的花和葉片基因組DNA，稀釋10倍待用。引物：UBC811，序列號(hào)(GA)8C。反應(yīng)體系：每20 μl中含1×PCR buffer、2.0 mmol/L MgCl2、0.3 μmol/L 引物、30 ng 模板DNA、0.5 UTaqDNA 聚合酶、dNTP 0.5 μmol/L。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，重復(fù)2～4，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

電泳：PCR產(chǎn)物在含EB的2.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，以DGL2000DNA作為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照。在Gel DocTMEQ凝膠成像儀系統(tǒng)紫外光下拍照[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA電泳及紫外檢測(cè)結(jié)果用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)由花和葉所提取DNA的完整性和大致分子量，檢測(cè)結(jié)果見圖1和圖2。用Varian UV-100紫外可見光分光光度計(jì)分別測(cè)定波長(zhǎng)260 nm和280 nm的光吸收值，根據(jù)A260估算樣品DNA得率，根據(jù)OD260/OD280判斷DNA的大致純度。檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 花與葉提取的DNA產(chǎn)物的純度和得率

從圖1和2可以看出，花基因組DNA條帶整齊無拖尾，但條帶亮度暗，點(diǎn)樣孔亮度高，前者表明DNA濃度低，后者則說明提取的DNA中雜質(zhì)較多。而葉基因組DNA電泳條帶整齊明亮，DNA也十分完整，點(diǎn)樣孔亮度較低，表明DNA濃度高且雜質(zhì)少[4]。

比較花與葉基因組DNA的外觀、純度和得率發(fā)現(xiàn)，由嫩葉提取的DNA沉淀干后無色透明，得率最高，為427.6 μg/g，DNA純度較高，OD260/OD280為1.809。由花提取的DNA淺黃褐色，得率遠(yuǎn)低于由嫩葉提取的DNA得率，為239.2 μg/g，OD260/OD280只有1.647。其原因可能是蠟梅花瓣內(nèi)酚類物質(zhì)濃度高，而在加入65 ℃預(yù)熱的CTAB提取液700 μl未迅速混勻，在水浴時(shí)振蕩不夠，由此導(dǎo)致酚類物質(zhì)氧化而呈現(xiàn)黃褐色[5]。

為提高花基因組DNA的濃度與純度，可將材料研磨得更充分，將其磨細(xì)后加入足量提取液搖勻，使待測(cè)樣品充分分散開，在材料、提取液的混合液較稀薄之后，由肉眼觀測(cè)可以在提取離心管中流暢流動(dòng)即可。然后將其放入65 ℃水浴振蕩器內(nèi)，振蕩頻率設(shè)定為300 r/min。經(jīng)DNA電泳和紫外檢測(cè)，其結(jié)果見圖3和表2。

表2 振蕩后由花提取DNA產(chǎn)物的純度和得率

由圖3可知，經(jīng)振蕩后花基因組DNA條帶整齊明亮，表明DNA濃度較高，但點(diǎn)樣孔亮度較高，有少量拖尾，說明提取的DNA中雜質(zhì)仍較多。由表2可知，經(jīng)振蕩后花基因組DNA得率增加到349.6 μg/g，可見經(jīng)振蕩后提取的DNA濃度明顯增加；OD260/OD280也增加到1.767，與葉基因組OD260/OD280也較接近。

針對(duì)提取的花基因組DNA中雜質(zhì)較多的現(xiàn)象，在提取DNA時(shí)進(jìn)行了2次抽提，抽提中，要充分混勻搖動(dòng)，時(shí)間以15 min為宜。2次抽提能去除殘留的蛋白質(zhì)。具體操作方法是在完成1.4中(4)的操作后再回到(3)，其后操作步驟相同。2次抽提后電泳檢測(cè)結(jié)果見圖4，紫外檢測(cè)結(jié)果見表3。

由圖4可知，經(jīng)2次抽提后花基因組DNA條帶整齊明亮，點(diǎn)樣孔亮度也較低，說明提取的DNA濃度較高且雜質(zhì)少。由表3可知，經(jīng)2次抽提后由花提取的DNA得率增加到410.3 μg/g，與嫩葉427.6 μg/g的得率非常接近；OD260/OD280也增加到1.798，在(1.8±0.1)的理論值內(nèi)，說明得到了較純的花基因組DNA。

表3 2次抽提后花基因組DNA產(chǎn)物的純度和得率

2.2 ISSR擴(kuò)增結(jié)果選取3組對(duì)應(yīng)花、葉基因組DNA進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在含有EB的2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，結(jié)果見圖5。由圖5可知，花與葉基因組DNA ISSR擴(kuò)增條帶非常接近，主帶和特征帶在亮度、位置、數(shù)量上幾乎完全一致。這說明基因組DNA的提取部位不同不會(huì)影響ISSR分子標(biāo)記的結(jié)果，這對(duì)于形態(tài)學(xué)分類中以花部形態(tài)為主要分

類依據(jù)的蠟梅而言，以花作為提取DNA的材料也是較好的選擇。

3 結(jié)論

在植物的遺傳多樣性分析中，傳統(tǒng)的DNA提取部位多為幼嫩的葉片，但對(duì)于蠟梅，尤其是野生種，它們開花季節(jié)、生長(zhǎng)地點(diǎn)等較為特殊，但有時(shí)它們的花又成為形態(tài)分類學(xué)上重要的因子，直接從花提取DNA就顯得更科學(xué)和方便，因此筆者對(duì)?？狄吧灻坊ㄅc葉基因組提取方法的研究表明，對(duì)于形態(tài)學(xué)分類中以花部形態(tài)為主要分類依據(jù)的蠟梅而言，以花作為提取DNA的材料也是較好的選擇，能達(dá)到葉基因組的效果。

[1] DOYLE J J，DOYLE J L.A rapid DNA isolationp rocedurefo rsm all quantitie of fresh leaf tissue[J].Phytochemical Bulletin，1987，19：11-15.

[2] JOSHI S P，GUPTA V S，AGGARWAL R K，et al.Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter-simple sequence repeat(ISSR)polymorphism in the genus Oryza[J].Theor Appl Genet，2000，100(8)：1311-1320.

[3] 繆恒彬，陳發(fā)棣，趙宏波.85個(gè)大菊品種遺傳關(guān)系的ISSR分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2007，34(5)：1243-1248.

[4] 郭春芳.11個(gè)茶樹品種遺傳多樣性的ISSR和TRAP比較分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24(1)：340-346.

[5] 黃文霞，何覺民，朱宏波.蓖麻種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17(1)：182-184，187.

Studies on Genomic DNA Extraction Methods of WildChimonanthuspraecoxFlower and Leaf in Baokang Country

YANG Yan-rong

(Journal of Xiangyang Vocational and Technical College, Xiangyang, Hubei 441050)

[Objective] The aim was to confirm thatChimonanthuspraecoxgenomic DNA extracted from the flower was equivalent to extract genomic DNA from the leaf.[Method] Using CTAB methods, genetic diversity of wildChimonanthuspraecoxflower and leaf genome in Baokang County were studied. [Result] When DNA was extracted using CTAB methods, after vibration in 65 ℃ water bath and two extractions, concentration and OD260/OD280value of flower total genome DNA were at similar standard to those of leaf total genome DNA. [Conclusion] DNA extracted from the more significant traitsChimonanthuspraecoxflower genome could reach the level of the leaf genome.

Chimonanthuspraecox；Flower；Leaf；Extraction；Amplification

楊艷容(1974-)，女，湖北枝江人，副教授，碩士，從事湖北?？狄吧参镔Y源及應(yīng)用研究。

2015-02-02

S 188

A

0517-6611(2015)09-033-02