杜振華，鮑布和，王仁杰，任黨利，張明華，劉冀琴

(武警后勤學院附屬醫(yī)院檢驗科，天津300162)

外周血DNT細胞及T細胞亞群變化與乙型肝炎慢性化的相關性研究

杜振華，鮑布和，王仁杰，任黨利，張明華，劉冀琴

(武警后勤學院附屬醫(yī)院檢驗科，天津300162)

目的探討外周血中CD3+CD4-CD8-(DNT)細胞及T細胞亞群變化與乙型肝炎病毒(HBV)感染慢性化的關系。方法用流式細胞術測定136例HBV感染者[33例無癥狀攜帶者(ASC)、28例急性乙型肝炎(AHB)、28例輕度慢性乙型肝炎(CHB)、25例中度CHB、22例重度CHB患者]及39名健康對照(HC)外周血中的DNT細胞及T細胞亞群。結果ASC組、AHB組、HC組DNT細胞比例分別為5.43%±3.31%、4.75%± 2.71%和4.82%±3.43%，3組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其中HC組和AHB組均低于CHB各組(由輕到重分別為7.97%±4.12%、8.41%±4.93%、11.36%±5.01%，P均＜0.05)，但ASC組僅顯著低于重度CHB組(P＜0.05)，與輕度CHB組和中度CHB組間差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);DNT細胞比例在輕度CHB組與中度CHB組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但二組均顯著低于重度CHB組(P均＜0.05)。HC組、AHB組、ASC組間T淋巴細胞亞群分布差異無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)，但隨著CHB患者病情加重CD3+、CD3+CD4+CD8-(CD4+)細胞比例降低，CD3+CD4-CD8+(CD8+)細胞比例升高。結論外周血DNT細胞比例的升高與HBV感染者慢性化關系密切，且與CHB患者的疾病進程有關。

CD3+CD4-CD8-細胞;T淋巴細胞亞群;急性乙型肝炎;慢性乙型肝炎

T淋巴細胞亞群檢測是評估機體免疫狀態(tài)的重要指標。乙型肝炎的發(fā)生、發(fā)展與宿主的細胞免疫狀態(tài)密切相關，目前認為宿主免疫調(diào)控紊亂是導致慢性肝損傷的主要原因，其中由T淋巴細胞亞群介導的細胞免疫以及細胞因子網(wǎng)絡的調(diào)控異常起著重要作用[1]。CD3+CD4-CD8-(double negative T，DNT)細胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一群具有免疫調(diào)節(jié)作用的T細胞亞群，占正常人外周血總淋巴細胞的1%～5%。DNT細胞被發(fā)現(xiàn)在免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制、自身免疫及抗腫瘤方面具有一定作用[2]。本研究利用流式細胞分析儀對外周血T淋巴細胞亞群進行檢測分析，包括CD3+CD4+CD8-(CD4+淋巴細胞)、CD3+CD4-CD8+(CD8+淋巴細胞)、DNT細胞亞群的變化，探討DNT淋巴細胞亞群在乙型肝炎診斷中的臨床意義。

材料和方法

一、研究對象

收集2012年4月至2014年4月武警后勤學院附屬醫(yī)院門診及住院患者136例，男74例，女62例，年齡(45.00±9.06)歲，其中乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)無癥狀攜帶者(asymptomatic carrier，ASC)33例，急性乙型肝炎(acute hepatitis B，AHB)患者28例，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者75例(輕度CHB患者28例、中度CHB患者25例、重度CHB患者22例)。39名健康對照(healthy control，HC)均為健康體檢者，男24名，女15名，年齡(42.00± 7.52)歲。全部病例的臨床診斷均符合2000年《病毒性肝炎防治方案》[3]。所有入選對象均在3個月內(nèi)未接受抗病毒及免疫抑制治療，且排除其它病毒感染及自身免疫性肝病。見表1。

二、儀器和試劑

流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司的FC 500。熒光抗體:熒光素標記抗體CD3-藻紅蛋白花青素5.1(phycoerythrin green pigment 5.1，PC5)/CD8-藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)/CD4-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC) (BeckmanCoulter公司)。紅細胞裂解液(BeckmanCoulter公司)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)。生化指標檢測采用日立全自動生化分析儀7180型。

表1 各組研究對象基本信息

三、方法

患者于清晨空腹采血，取血后1 h內(nèi)進行檢測，過程如下:取乙二胺四乙酸鉀(ethylene diamine tetraacetic acid-K2，EDTA-K2)抗凝外周血樣50 μL，加入10 μL的三標記單克隆抗體復合試劑(CD3-PC5、CD4-FITC、CD8-PE)，充分混勻，室溫避光20 min后加入250 μL紅細胞裂解液(OptiLyse?C lysing solution)，充分混勻后室溫避光10 min。然后加入1 mL PBS，混勻后300×g離心5 min，棄去上清，用1 mL PBS重懸，300×g離心5 min，用500 μL PBS重懸后10 min內(nèi)上機檢測。流式細胞儀檢測10 000個淋巴細胞，各細胞亞群分別用百分比表示。同步在全自動生化儀上檢測患者血清ALT、AST水平。

四、統(tǒng)計學方法

結果

一、乙型肝炎患者各組與HC組間DNT細胞水平比較

ASC組、AHB組和HC組DNT細胞比例分別為5.43%±3.31%、4.75%±2.71%和4.82%± 3.43%，3組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，CHB組DNT細胞比例較HC組和AHB組顯著升高(P＜0.05)，輕度CHB組DNT細胞比例(7.97%±4.12%)與中度CHB組(8.41%± 4.93%)間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，重度CHB組(11.36%±5.01%)則顯著高于上述2組(P＜0.05)，ASC組顯著低于重度CHB組(P＜0.05)，與輕度CHB組和中度CHB組間差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖1。

二、乙型肝炎患者各組與HC組間T淋巴細胞亞群分布情況

HC組、ASC組、AHB組CD3+細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，且均顯著高于CHB組(P＜0.05)。輕度CHB組CD3+細胞比例與中度CHB組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但均顯著高于重度CHB組(P＜0.05)。

HC組、ASC組、AHB組CD4+淋巴細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);HC組和ASC組CD 4+淋巴細胞比例顯著高于CHB組(P＜ 0.05)。輕度CHB組CD4+淋巴細胞比例顯著高于重度CHB組(P＜0.05);AHB組CD4+淋巴細胞比例顯著高于中度CHB組和重度CHB組(P＜0.05)。CD4+淋巴細胞比例在中度CHB組和重度CHB組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖1 各組間DNT細胞比例比較

HC組、ASC組、AHB組間CD8+淋巴細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，且三者CD8+淋巴細胞比例均顯著低于CHB組(P＜0.05)。輕度CHB組、中度CHB組、重度CHB組間CD8+淋巴細胞水平依次遞增(P＜0.05)。

HC組、ASC組、AHB組3組間CD4+/CD8+比值差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，且三者均顯著高于CHB組(P＜0.05)。輕度CHB組顯著高于重度CHB組(P＜0.05)，而中度CHB組與重度CHB組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 HBV感染各組與HC組外周血T淋巴細胞亞群比較(±s)

表2 HBV感染各組與HC組外周血T淋巴細胞亞群比較(±s)

注:與HC組比較，*P＜0.05;與AHB組比較，#P＜0.05;與輕度CHB組比較，△P＜0.05;與中度CHB組比較，▲P＜0.05;與重度CHB組比較，□P＜0.05

組別CD3+細胞(%)CD4+細胞(%)CD8+細胞(%)CD4+/CD8+HC組71.3±6.8141.54±6.2324.59±4.551.69±0.43 71.08±7.0440.58±6.2824.84±5.961.77±0.62 ASC組70.79±8.92△▲□42.03±8.36△▲□24.61±4.56△▲□1.76±0.49△▲□CHB輕度組62.38±9.24*#33.57±8.36*30.29±8.91*#1.23±0.49*#中度組57.66±9.97*#30.63±4.78*#36.02±8.12*#△0.93±0.31*#△重度組43.92±8.72*#△▲26.1±5.21*#△42.63±7.08*#△▲0.65±0.19*#△AHB組

討論

HBV感染機體后，主要有2種結局:急性自限性和慢性持續(xù)。機體能否清除病毒，很大程度上取決于感染者的免疫狀態(tài)。當機體免疫功能強大時，可發(fā)生劇烈的炎癥反應，臨床上可出現(xiàn)較重的AHB，甚至急性或亞急性重型肝炎，但患者臨床痊愈時，HBV被徹底清除;而當機體免疫力弱時，炎癥反應較弱，往往機體內(nèi)的HBV不能徹底清除而病情遷延成為CHB或ASC。大量研究表明，病毒性肝炎肝臟損傷的機制來源于免疫應答而非病毒的細胞病理效應，病毒特異性的CD8+T細胞被認為在肝臟的損傷和病毒控制過程中起重要作用，此外，CD4+T細胞輔助反應與肝炎急性期的病毒清除密切相關[4]。DNT細胞是最新發(fā)現(xiàn)的一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的T淋巴細胞亞群，其與機體的免疫調(diào)節(jié)和免疫防御功能有關，也被證明在抗移植排斥、腫瘤免疫、自身免疫病等方面發(fā)揮重要作用[2，5]。已被發(fā)現(xiàn)DNT細胞的功能包括抗原特異性的免疫調(diào)節(jié)功能，對CD4+T細胞、CD8+T細胞、自然殺傷細胞及樹突狀細胞的免疫抑制功能等[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)，CHB組DNT細胞比例較HC組、ASC組和AHB組明顯升高，且隨著CHB病情的加重，DNT細胞水平也呈上升趨勢，與孫穎等[7]在動物模型上的發(fā)現(xiàn)相一致，可見外周血DNT細胞水平與HBV感染患者的疾病轉歸關系密切，可能與其慢性化有關。乙型肝炎慢性化可能是機體免疫功能低下的結果，包括產(chǎn)生抗病毒抗體的體液免疫和清除細胞內(nèi)病毒的細胞免疫。已知抗原特異性的CD8+T細胞是清除病毒的主要效應細胞。動物研究發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)DNT細胞可以殺死活化的特異性CD8+T細胞[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)在HBV感染過程中，DNT細胞能通過抑制宿主免疫反應來起到保護肝臟損傷的功能，但同時也會造成病毒無法徹底清除而持續(xù)存在[10]。LAI等[11]的研究就發(fā)現(xiàn)DNT細胞限制了CD8+T細胞對HBV的清除作用，從而影響了CHB患者的轉歸，這與我們的研究相符(ASC組和CHB組DNT細胞水平較HC組和AHB組水平明顯升高)。因此，DNT細胞的多種免疫功能，在HBV感染過程中可能是一把雙刃劍，其能發(fā)揮類似Th1細胞的功能，從而促進病毒的清除，但也能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，通過抑制細胞毒性CD8+T細胞來達到保護肝臟的目的，而二者達到動態(tài)平衡的過程也就是HBV慢性化的過程[10]。本研究發(fā)現(xiàn)CHB進行過程中CD8+T細胞比例并未因DNT細胞水平的升高而有所降低，我們推測這可能是由于CHB患者體內(nèi)HBV抗原特異性CD8+T細胞數(shù)量減少，大量非病毒特異性CD8+T細胞產(chǎn)生，從而一方面導致CD8+T細胞無法有效發(fā)揮病毒清除功能，反而對肝細胞的損傷加重;另一方面導致DNT細胞對HBV抗原特異性CD8+T細胞的調(diào)控作用失效，但隨著病情的發(fā)展，DNT細胞水平代償性升高，并且由于其對CD4+T細胞和抗原呈遞細胞也存在抑制作用，因此高水平的DNT細胞又抑制了由CD4+T細胞誘導的免疫防御作用，從而又反過來促進了病情的惡化。這點可以從葉海燕等[12]的研究中得到部分證實，他們發(fā)現(xiàn)AHB組的HBV抗原特異性CD8+T細胞水平明顯比CHB患者高。關于DNT細胞在CHB惡化過程中的具體機制有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，HC組、ASC組、AHB組間T淋巴細胞亞群分布無明顯差異，但CHB組中隨著患者病情的加重，其CD3+細胞、CD4+T細胞水平逐漸減低，CD8+T細胞水平逐漸升高，CD4+/CD8+細胞比值逐漸減低并出現(xiàn)倒置，這與國內(nèi)外的一些研究結果相一致[13-15]。AHB組T淋巴細胞亞群的分布情況與劉波等[16]的報道結果不同，他們發(fā)現(xiàn)早期AHB患者外周血CD3+、CD4+和CD8+T細胞頻率顯著高于CHB組和HC組。這可能是由于病例選擇的差異造成的。

總之，DNT細胞作為T細胞發(fā)揮調(diào)控功能的組成部分，與HBV感染慢性化有關，也與CHB患者的疾病進程有關。外周血T淋巴細胞亞群是反映機體免疫狀態(tài)的主要指標，外周血DNT細胞和T淋巴細胞亞群檢測將會對評估HBV感染者預后及疾病進程有重要價值。

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(本文編輯:姜敏)

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Correlation analysis on the changes of DNT cells and T lymphocyte subsets in the chronic progress of hepatitis B

DU Zhenhua，BAO Buhe，WANG Renjie，REN Dangli，ZHANG Minghua，LIU Jiqin.(Department of Clinical Laboratory，the Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People's Armed Police Force，Tianjin 300162，China)

ObjectiveTo investigate the changes of CD3+CD4-CD8-(DNT)cells and T lymphocyte subsets in the chronic progress of hepatitis B virus(HBV)intection.MethodsDNT cells and T lymphocyte subsets of peripheral blood were detected by flow cytometry in 136 patients with HBV infection，including 33 cases of asymptomatic carrier (ASC)，28 cases of acute hepatitis B(AHB)，28 cases of mild chronic hepatitis B(CHB)，25 cases of moderate CHB，22 cases of severe CHB，and 39 healthy controls(HC).ResultsDNT cell percentages in ASC，AHB and HC groups were 5.43%±3.31%，4.75%±2.71%and 4.82%±3.43%，and there was no statistical significance among the 3 groups(P＜0.05).DNT cell percentages in HC and AHB group were lower than that in CHB group(from mild group to severe group，DNT cell percentages were 7.97%±4.12%，8.41%±4.93%and 11.36%±5.01%，P＜0.05).The DNT percentage in ASC group was only lower than that in severe CHB group(P＜0.05).The DNT percentage had no statistical significance in severe CHB group with those in mild CHB and moderate CHB groups(P＞0.05).There was no statistical significance for DNT cell percentages between mild and moderate CHB groups(P＞0.05)，and they were significantly lower than that in severe group(P＜0.05).There was no statistical significance for T lymphocyte subsets in HC group，AHB group and ASC group(P＞0.05).With the development of CHB，the percentages of CD3+and CD3+CD4+CD8-(CD4+)cells decreased，and the percentages of CD3+CD4-CD8+(CD8+)cells increased.ConclusionsThe increasing of peripheral blood DNT cell percentage is associated with the progress of CHB.

CD3+CD4-CD8-cell;T lymphocyte subset;Acute hepatitis B;Chronic hepatitis B

1673-8640(2015)07-0723-05

R446.63

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.07.013

2014-09-02)

杜振華，男，1985年生，碩士，技師，主要從事臨床檢驗基礎研究。

張明華，聯(lián)系電話:022-60577191。