梁艷明 李嫣

遼寧省錦州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧錦州121000

同源異形盒A10及上皮性鈣黏蛋白在人子宮內膜癌組織中的表達

梁艷明 李嫣

遼寧省錦州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧錦州121000

目的探討同源異型盒基因A10（HOXA10）及上皮性鈣黏蛋白（E-cad）在人子宮內膜癌組織中的表達及其相關性，探討二者在子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展及浸潤轉移中的作用。方法選取錦州市中心醫(yī)院2012年1月～2013年1月手術切除的40例子宮內膜癌存檔蠟塊作為實驗對象，選擇同期因良性病變切除子宮的正常子宮內膜標本30例作為對照。免疫組化實驗檢測子宮內膜癌和正常子宮內膜標本中HOXA10和E-cad蛋白的表達。結果子宮內膜癌中HOXA10蛋白的陽性表達率低，E-cad蛋白的正常表達率低，與正常子宮內膜比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；并與子宮內膜癌的組織學分級、臨床分期、肌層浸潤深度、有無淋巴結轉移有關（P＜0.05）；二者在子宮內膜癌中的表達呈中度正相關（r=0.448，P＜0.05）。結論子宮內膜癌組織HOXA10表達下降或缺失可能通過某種機制下調了E-cad的表達，通過上皮間質轉化途徑促進了腫瘤的轉移和侵襲。聯(lián)合檢測HOXA10和E-cad在子宮內膜癌的表達，可能有助于了解子宮內膜癌的惡性程度。

同源異形盒基因A10；E-鈣黏蛋白；子宮內膜癌；表達

子宮內膜癌為女性生殖道三大惡性腫瘤之一，近20多年，在全世界范圍內發(fā)病率有上升趨勢[1]，其發(fā)生發(fā)展及浸潤轉移機制仍為研究的熱點。HOXA10基因與女性生殖系統(tǒng)發(fā)育及女性生殖有密切關系[2]，HOXA10基因與子宮內膜癌的關系近年也有少量報道，但研究結果不一致，尚需進一步研究。E-cad是鈣黏素家族（CAD）的重要成員，為一類細胞間黏附分子，在上皮細胞完整性和極性維持方面起重要作用[3]，多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)E-cad的表達喪失與上皮源性腫瘤細胞惡變、侵襲和轉移增高有關，因此被稱為侵襲抑制基因[4]。E-cad等異常表達也是發(fā)生上皮間質轉化的重要標志[5]。關于HOXA10和E-cad在子宮內膜癌中的表達及其相互關系國內報道很少，本實驗采用免疫組化法檢測HOXA10和E-cad在正常子宮內膜和子宮內膜癌中的表達情況，并結合臨床病理學特征進行分析，以探討它們與子宮內膜癌惡性程度及預后之間的關系，為探討其在子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展中的可能機制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取錦州市中心醫(yī)院2012年1月～2013年1月手術切除的40例子宮內膜癌存檔蠟塊作為實驗對象，手術采用筋膜外全子宮切除或廣泛子宮切除術加雙側附件切除術加盆腔淋巴結清掃術，病理類型全部為子宮內膜樣腺癌；選擇同期因非雌激素依賴疾病良性病變切除子宮的正常子宮內膜標本30例作為對照。以上標本均經(jīng)病理學確診，有完整的臨床資料，全部病例術前均未接受放療、化療或性激素治療。子宮內膜癌患者中包括10例2型糖尿病患者及8例高血壓病患者，年齡43～75歲，平均53.8歲；正常子宮內膜患者中納入了2型糖尿病患者7例，高血壓病患者6例，年齡40～65歲，平均52歲。兩組研究對象無其他內分泌疾病，兩組年齡、合并癥比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。子宮內膜癌患者包括不同的分期、分級、肌層浸潤深度及淋巴結轉移情況。

1.2 實驗方法

兔抗人E-cad多克隆抗體（Santa Cruz），兔抗人HOXA10多克隆抗體（Santa Cruz），通用型PV-9000試劑盒及DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。所有石蠟標本進行4μm連續(xù)切片，采用即用型SP二步法免疫組化檢測。免疫組化染色步驟：切片常規(guī)脫蠟水化；3%過氧化氫溶液室溫下浸泡阻斷內源性過氧化物酶；高壓修復；分別滴加兔抗人多克隆E-cad抗體（1∶100）及兔抗人HOXA10多克隆抗體（1∶200），4℃冰箱過夜；滴加通用型PV-9000試劑盒中的試劑Ⅰ，37℃水浴箱內孵育20 min；滴加通用型PV-9000試劑盒中的試劑Ⅱ，37℃水浴箱內孵育20 min；DAB顯色；蘇木精復染細胞核；常規(guī)脫水透明封片，顯微鏡觀察。分別用PBS代替2種一抗為陰性對照，用已知陽性組織切片作陽性對照。

1.3 免疫組化結果判定

HOXA10表達以細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，高倍鏡下觀察200個細胞，連續(xù)5個高倍視野，不少于1000個腫瘤細胞。根據(jù)陽性細胞占同類細胞的百分比分為：陰性（-）：陽性細胞＜10%；弱陽性（+）：陽性細胞10%～＜25%；陽性（++）：陽性細胞25%～50%；強陽性（+++）：陽性細胞＞50%，將陽性與強陽性定為陽性表達，將弱陽性與陰性定為陰性表達[6]。E-cad表達以連續(xù)的細胞膜染色為正常表達，每片觀察至少10個具代表性高倍視野，不少于1000個腫瘤細胞，對其中的陽性細胞進行計數(shù)。評分標準[7]：0分，陽性細胞數(shù)＜10%；1分，細胞質染色為主，陽性細胞數(shù)10%～90%；2分，細胞膜、細胞質混合染色，陽性細胞數(shù)10%～90%；3分，連續(xù)的細胞膜染色，陽性細胞數(shù)＞90%。將無連續(xù)的細胞膜染色視為異常，即0～2分為異常表達，3分為正常表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗、Fisher確切概率法，相關性采用Spearman相關分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HOXA10及E-cad蛋白在子宮內膜組織中的表達

HOXA10蛋白在子宮內膜癌中的陽性表達率低，E-cad在子宮內膜癌組織中的異常表達率高，與正常子宮內膜比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 HOXA10及E-cad蛋白在子宮內膜組織中的表達[n（%）]

2.2 HOXA10及E-cad蛋白在子宮內膜癌中的表達

子宮內膜癌患者中，年齡組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），隨著子宮內膜癌組織學分級的升高，HOXA10的陽性表達率有逐漸降低趨勢，高分化G1級與低分化G3級之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。G1級與中分化G2級比較、G2級與G3級比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。隨著子宮內膜癌臨床分期的增高，HOXA10的陽性表達率逐漸降低：Ⅰ期與Ⅲ～Ⅳ期比較差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Ⅰ期與Ⅱ期、Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。肌層浸潤深度＞1/2者與浸潤深度≤1/2者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。HOXA10在有淋巴結轉移子宮內膜癌組織中的陽性表達率為0.0%，在無淋巴結轉移子宮內膜癌組織中的陽性表達率為52.9%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

隨著子宮內膜癌組織學分級的升高，E-cad的異常表達有逐漸升高趨勢，G1級與G3級之間比較有差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；G1級與G2級、G2級與G3級比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。隨著子宮內膜癌臨床分期的增高，E-cad的異常表達率逐漸升高，Ⅰ期與Ⅲ～Ⅳ期比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Ⅰ期與Ⅱ期比較、Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。子宮肌層浸潤深度＞1/2者與浸潤深度≤1/2者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。E-cad在有淋巴結轉移子宮內膜癌組織中的異常表達率為100.0%，在無淋巴結轉移子宮內膜癌組織中的異常表達率為44.1%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2、圖1（封三）。

表2 HOXA10及E-cad在子宮內膜癌中的表達[n（%）]

2.3 子宮內膜癌中HOXA10與E-cad表達的相關性分析

在40例子宮內膜癌中，HOXA10陰性表達占22例，E-cad在HOXA10陰性組中的異常表達率為72.7%（16/22），經(jīng)相關檢驗，呈中度正相關（r=0.448，P＜0.05）。見表3。

表3 子宮內膜癌中HOXA10和E-cad表達關系（例）

3 討論

3.1 HOXA10蛋白在子宮內膜癌組織中表達下調

子宮內膜癌指原發(fā)于子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤，為女性生殖道常見的三大惡性腫瘤之一，多見于老年婦女，國內高發(fā)年齡為50～60歲，平均55歲，目前發(fā)病有年輕化趨勢，40歲以下婦女發(fā)病率呈上升趨勢[1]。近20多年，由于人類壽命延長、肥胖婦女增加、外源性雌激素的廣泛應用，子宮內膜癌在全世界范圍內發(fā)病率有上升趨勢，在某些歐美國家子宮內膜癌發(fā)病率已位居女性生殖道惡性腫瘤首位，國外報道其發(fā)病率為10/10萬～20/10萬[8]，但其發(fā)生發(fā)展的機制仍不明確。目前，盡管子宮內膜癌的5年生存率可達到80%[9]，明顯高于其他婦科惡性腫瘤，但深肌層浸潤、低分化、特殊病理類型以及有淋巴結轉移仍然是疾病復發(fā)的風險因素，因此對于腫瘤浸潤轉移機制及判斷預后的分子標志物的研究一直受到關注。

多數(shù)學者認為，腫瘤的發(fā)生重現(xiàn)了胚胎早期發(fā)育及胚胎畸變的過程[2]。因此目前對于胚胎發(fā)育相關基因與腫瘤發(fā)生的研究已成為分子腫瘤學的又一研究熱點，同源異型盒基因就是其中具有代表性的一個。同源異型盒基因是一類控制胚胎發(fā)育和細胞分化的調節(jié)基因，包含39個成員，分4個簇A、B、C、D，每簇分為1～13組，其中9～13與生殖器官發(fā)育有重要關系[10]。研究顯示在胚胎發(fā)育過程中HOXA10基因突變的小鼠其子宮發(fā)生畸變[11]，女性成年后，HOXA10基因與胚胎著床和子宮內膜容受性有密切關系[12]。隨著對HOXA10基因的研究深入，發(fā)現(xiàn)其異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關。已發(fā)現(xiàn)，HOXA10基因的異常表達與胃癌的不良預后有關[13]；與卵巢子宮內膜樣腺癌的分化及進展有關[14]；可能通過調節(jié)P53基因的表達從而改變了乳腺癌細胞的侵襲能力等[15]。HOXA10基因與子宮內膜癌的關系近年也有少量報道，Lane等[16]檢測結果顯示HOXA10在G2、G3內膜癌中表達增高，但Yoshida等[2]研究指出，子宮內膜癌組織及細胞中HOXA10蛋白及mRNA表達下降，可能與HOXA10基因啟動子甲基化有關。最近Zhang等[10]的一項研究發(fā)現(xiàn)，子宮內膜癌組織中HOXA10的蛋白及mRNA的表達低于正常子宮內膜組織，并與子宮內膜癌分級有關，研究同時發(fā)現(xiàn)了p21蛋白的表達下調，HOXA10基因可能參與了子宮內膜癌細胞周期的調控。本研究發(fā)現(xiàn)：HOXA10主要表達在正常子宮內膜中，與之前的研究報道一致。子宮內膜癌組織中HOXA10蛋白的表達明顯低于正常子宮內膜，Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結轉移及肌層浸潤深度＞1/2的子宮內膜癌組織標本中，HOXA10蛋白表達陽性率明顯降低，均提示HOXA10在子宮內膜癌中的表達與腫瘤的惡性程度和轉移侵襲能力有關，HOXA10有可能作為新的生物學標志來預測腫瘤的惡性潛能，但具體機制尚需進一步研究。

3.2 HOXA10可能通過上皮間質轉化過程參與了子宮內膜癌的轉移及侵襲過程

上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞失去極性，轉化為成纖維細胞形態(tài)與周圍細胞的接觸減少，細胞黏附力下降，遷移和運動能力增加，是腫瘤浸潤及轉移的關鍵機制[8]。研究表明，發(fā)生EMT時涉及幾個重要的步驟，每步都包含不同的分子機制，其中包括上皮細胞失去極性，表現(xiàn)為E-cad復合體在整個細胞漿膜上重新分布、進而喪失E-cad表達的過程，上皮細胞的標志物如E-cad等表達下調是發(fā)生EMT的重要標志[17]。E-cad表達的缺失則導致細胞黏附能力下降，分散能力加強，使細胞脫離瘤體，使多種腫瘤細胞如乳腺癌、口腔癌等發(fā)生浸潤及轉移的能力增強[5,17-18]。Tanaka等[9]研究發(fā)現(xiàn)晚期的、肌層浸潤深度＞1/2及有淋巴結轉移的子宮內膜癌標本中E-cad的表達明顯下調，E-cad表達下調與EMT狀態(tài)可作為子宮內膜癌獨立的預后因子，對EMT信號分子的調控也許會成為子宮內膜癌分子靶向治療的一個方向。本研究檢測了人子宮內膜癌組織中E-cad的表達情況，發(fā)現(xiàn)E-cad在子宮內膜癌細胞膜上均有不同程度的缺失，子宮內膜癌組織中E-cad蛋白存在異常表達，且與腫瘤分化程度、臨床分期、肌層浸潤深度和淋巴結轉移有關，揭示EMT在子宮內膜癌的進展中發(fā)揮著關鍵性的作用，E-cad表達的改變可作為一種評價子宮內膜癌轉移潛能的指標。

Yoshida等[2]在其研究中發(fā)現(xiàn)：HOXA10蛋白在子宮內膜癌組織中表達下調，與腫瘤分級有關，轉染HOXA10的內膜癌細胞系中觀察到了E-cad的表達上調，得出結論：子宮內膜癌中HOXA10表達缺失可以下調E-cad的表達，可能通過促進EMT過程而使腫瘤發(fā)生侵襲轉移。本研究結果發(fā)現(xiàn)在40例子宮內膜癌中，HOXA10和E-cad二者表達呈中度正相關關系，推測子宮內膜癌組織中HOXA10表達下降或缺失可能通過某種機制下調了E-cad的表達，參與了EMT途徑從而促進了子宮內膜癌的轉移和侵襲。HOXA10具體通過何種信號轉導途徑誘發(fā)了子宮內膜癌細胞的EMT過程，如何阻斷這一過程，可能成為未來進一步深入研究的方向，臨床上聯(lián)合檢測HOXA10及E-cad可能有助于判斷子宮內膜癌的預后。

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Expression of HOXA10 and E-cad in endometrial carcinoma

LIANG Yanming LI Yan
Department of Gynecology and Obstetrics,Jinzhou Central Hospital,Liaoning Province,Jinzhou 121000,China

ObjectiveTo explore the expression and correlation of homeobox gene A10(HOXA10)and E-cadherin(E-cad)in endometrial carcinoma,and to investigate the effect of HOXA10 and E-cad during the development and metastasis of endometrial carcinoma.MethodsParaffin blocks on file removed by surgery from 40 women with endometrial carcinoma in Jinzhou Central Hospital from January 2012 to January 2013 were selected as experimental subject,and normal endometrium specimens from 30 women taking hysterectomy because of benign lesion were selected as controls. The expression of HOXA10 and E-cad proteins in endometrial carcinoma and normal endometrium was detected by immunohistochemical technique.ResultsThe positive expression rate of HOXA10 protein in endometrial carcinoma was obviously lower,the normal expression rate of E-cad protein in endometrial carcinoma was obviously lower,which had significant differences compared with normal endometrium(P＜0.05);the expression of HOXA10 and E-cad proteins in endometrial carcinoma was correlated with histological grade,clinical stages.depth of myometrial invasion,whether there was lymphatic metastasis(P＜0.05);both showed moderate positive correlation in the expression of endometrial carcinoma(r=0.448,P＜0.05).ConclusionThe declined or missing expression of HOXA10 in endometrial carcinoma may lower the expression of E-cad through certain mechanisms,and promote the metastasis and invasion of tumor through the transformed way of epithelial and stromal.The combined detection of the expression of HOXA10 and E-cad proteins in endometrial carcinoma may help to understand the grade malignancy of endometrial carcinoma.

Homeobox gene A10;E-cadherin;Endometrial carcinoma;Expression

R737.31

A

1673-7210（2015）07（b）-0093-04

2015-01-14本文編輯：張瑜杰）