湯化琪 張志千 汪文琪 李丹丹 夏坤 蘇爽 王景紅 孫毅坤

1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京100102；2.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院藥學部，北京100102

宣痹洗劑中羥基紅花黃色素A的含量測定

湯化琪1張志千1汪文琪1李丹丹1夏坤2蘇爽2王景紅2孫毅坤1

1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京100102；2.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院藥學部，北京100102

目的測定宣痹洗劑中羥基紅花黃色素A的含量。方法采用高效液相色譜法，以羥基紅花黃色素A含量為指標，通過正交試驗確定正丁醇萃取的最佳條件并測定其含量。結(jié)果宣痹洗劑中羥基紅花黃色素A的最佳正丁醇萃取條件為正丁醇用量60 mL，萃取4次，每次振搖50 s，各因素影響順序為正丁醇用量＞萃取次數(shù)＞振搖時間，測得宣痹洗劑中羥基紅花黃色素A的含量為0.39μg/mL，平均回收率為97.06%，RSD=1.4%（n=6）。結(jié)論本研究建立的正丁醇萃取方法與含量測定方法簡便快速、精密度高，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

宣痹洗劑；羥基紅花黃色素A；正丁醇萃??；含量測定；高效液相色譜法

宣痹洗劑是由威靈仙、紅花等藥材經(jīng)水煎煮制成的復方制劑，具有散寒除濕、活血止痛之功效，臨床用于治療痹癥寒濕閉阻、淤血阻絡證，癥見膝關(guān)節(jié)疼痛，局部畏惡風寒、活動不利、蹲起困難，下肢沉重，晨僵，舌淡苔白，脈弦；膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎見上述證候者。紅花為本方臣藥，是菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，《本草綱目》中記載紅花有“活血、潤燥、止痛、散腫、通經(jīng)”之功效，因此備受國內(nèi)外學者關(guān)注。紅花所含成分主要為色素、黃酮類、揮發(fā)油、脂肪酸、酚酸等[1-2]。其中羥基紅花黃色素A，是紅花活血化瘀有效成分之一，其在1993年被Meselhy等人首次分離得到，是紅花黃色素的主要成分，《中國藥典》2010年版一部規(guī)定以其作為紅花中的代表性活性成分進行含量測定，多被用于紅花相關(guān)制劑質(zhì)量標準的含測指標[3-4]。為保證藥品質(zhì)量，本研究對宣痹洗劑中羥基紅花黃色素A的含量測定進行了研究，采用正交設計優(yōu)化了正丁醇萃取的前處理方法，結(jié)果表明，該方法簡便、準確、重復性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1100型高效液相色譜儀（UV檢測器，美國Aglient公司）；AE-240型電子天平（瑞士Mettler公司）。

1.2 試藥

羥基紅花黃色素A對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111637-200502）；宣痹洗劑樣品（批號：121201、121202、121203）由中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院制劑中心提供；甲醇為色譜純，實驗用水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters Symmetry Shiled-RP18（150 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱，以0.1%磷酸甲醇-0.1%磷酸（29∶71）為流動相，流速1 mL/min，檢測波長403 nm，柱溫25℃。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取羥基紅花黃色素A對照品適量，加25%甲醇制成每1毫升含10.0μg的溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取樣品50.0 mL，置分液漏斗中，加水飽和正丁醇60 mL，振搖萃取4次，每次50 s，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加25%甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL棕色量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 正丁醇萃取方法研究

以羥基紅花黃色素A的含量為指標，采用L9（34）正交設計表，以正丁醇用量、萃取次數(shù)、振搖時間為考察因素進行正交試驗[5-6]，正交試驗因素水平與結(jié)果見表1～3。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析

由表2可知，正交試驗極差R的大小順序為A＞B＞C，即影響宣痹洗劑中羥基紅花黃色素A得率的各因素主次關(guān)系依次為正丁醇用量＞萃取次數(shù)＞振搖時間，其中正丁醇用量對得率的影響極顯著，其次為萃取次數(shù)與振搖時間，而振搖50 s與振搖70 s的萃取效果基本接近，為節(jié)省時間，故選擇50 s作為振搖時間，因此確定最佳萃取條件為A3B3C2，即正丁醇用量60 mL，萃取4次，每次振搖50 s。

2.5 陰性樣品溶液的制備

按處方比例與工藝制備不含紅花的陰性樣品，按“2.3”項下方法制備陰性樣品溶液。在上述色譜條件下，對照品、樣品及陰性樣品的液相色譜圖見圖1。結(jié)果表明，樣品中其他成分對羥基紅花黃色素A的測定無干擾。

圖1 宣痹洗劑高效液相色譜圖

3 方法學考察

3.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品溶液4、6、8、10、12、14μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y=917.17X+0.16，r=0.9997（n=6）。結(jié)果表明，羥基紅花黃色素A進樣量在0.04～0.14μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 精密度試驗

精密吸取對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，RSD為1.73%，表明儀器精密度良好。

3.3 重復性試驗

精密量取樣品6份，分別按“2.3”項下方法，以上述最佳萃取方法制備供試品溶液，并按“2.4”項下色譜條件進樣20μL，測定峰面積，計算含量。結(jié)果羥基紅花黃色素A的平均含量為0.3757μg/mL，RSD為2.0%，表明該方法重復性良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣20μL，測得峰面積的RSD為1.8%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5 加樣回收率試驗

精密量取已知含量（0.3757μg/mL）的同批樣品25 mL共6份，分別置分液漏斗中，精密加入對照品溶液（10.02μg/mL）各1.0 mL，分別按“2.3”項下方法，以上述最佳萃取方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件進樣20μL，計算回收率，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果

3.6 樣品測定

取不同批次樣品5份，分別按“2.3”項下方法，以上述最佳萃取條件制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件進樣20μL，以外標法計算得到其中羥基紅花黃色素A的含量為0.39μg/mL，RSD為1.5%。

4 討論

羥基紅花黃色素A是紅花中主要成分之一，具有活血化瘀、通脈止痛等功效。現(xiàn)代研究表明，羥基紅花黃色素A可以擴張冠狀動脈、改善心肌缺血，降低血壓，保護脊髓出血/再灌注損傷，具有抗凝、抗血小板聚集和血管再通作用，能有效緩解不穩(wěn)定性心絞痛（UA）、降低纖維蛋白原濃度、清除自由基、控制心絞痛的發(fā)作及向心肌梗死的轉(zhuǎn)化、抗疲勞及耐缺氧等藥理作用。

目前，羥基紅花黃色素A的提取、分離以及純化工藝得到了很大的改進，且其在紅花中含量的定量分析方法先進，體內(nèi)的藥物代謝方式也已明確。且其多項藥理作用雖然已有報道，但仍然是國內(nèi)外研究的熱點，一方面是其在靶細胞及分子水平的作用機制尚有待于進一步深入探究；另一方面是與其他中藥活性組分的配伍所產(chǎn)生的新療效及其作用機制需要在分子、細胞、整體動物多個層次予以系統(tǒng)揭示。因此，這就需要對不同制劑中羥基紅花黃色素A的提取、分離、純化等處理手段以及含量測定進行進一步深入的研究。

正交試驗設計和分析方法是目前最常用的工藝優(yōu)化試驗設計和分析方法，是部分因子設計的主要方法。正交試驗以概率論、數(shù)理統(tǒng)計和實踐經(jīng)驗為基礎，利用標準化正交表安排試驗方案，并對結(jié)果進行計算分析，最終迅速找到優(yōu)化方案，是一種高效處理多因素優(yōu)化問題的科學計算方法。正交設計法就是利用正交表處理多因素多水平試驗的一種科學方法。該法能以盡可能少的試驗次數(shù)，獲得最滿意的試驗結(jié)果，篩選出最佳試驗條件，找出影響試驗結(jié)果的主要因素，從而為在醫(yī)藥科學研究中多因素多水平問題提供了科學的、合理的解決途徑，并日益廣泛地應用于中藥研究中。在工藝條件的優(yōu)選工作中具有廣闊的應用前景，只是在用正交設計法探討工藝條件時，受測試指標及所選因素、水平的影響很大，這樣選擇科學合理的測試指標、因素、水平就成了整個實驗的重要步驟，對能否獲得最佳工藝參數(shù)具有重要意義。

本研究以宣痹洗劑為載體，以羥基紅花黃色素A含量為考察指標，采用正交試驗優(yōu)化得到正丁醇最佳萃取條件為：正丁醇用量60 mL，萃取次數(shù)4次，振搖時間50 s，并測得其中羥基紅花黃色素A的含量為0.39μg/mL。

在羥基紅花黃色素A含量測定研究中，參照《中國藥典》2010年版及相關(guān)文獻[7-12]，對流動相選擇與比例、柱溫、檢測波長等因素進行了考察。因干擾峰的存在，對流動相進行調(diào)整，經(jīng)比較選定0.1%磷酸甲醇-0.1%磷酸（29∶71）為流動相時最佳。羥基紅花黃色素A是具有單查耳酮苷類結(jié)構(gòu)的化合物，極性較強，且呈酸性，在流動相中加入少量磷酸以抑制其離解，可改善其峰形及分離效果。

劉亮等[5]的研究結(jié)果表明，振搖時間對萃取效果無顯著性影響，而本研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)振搖時間對萃取效果有顯著影響，這可能是因為振搖時間太短，樣品溶液不能與正丁醇充分混合，從而影響萃取效果所造成。而本研究結(jié)果亦顯示振搖時間為50 s與70 s時萃取效果接近，這可能是振搖50 s時樣品即與正丁醇充分混合，故選擇50 s作為最佳萃取時間，在節(jié)省時間的同時，達到了最佳萃取效果。

通過預實驗比對發(fā)現(xiàn)，如未進行正丁醇萃取，宣痹洗劑中其他成分對羥基紅花黃色素A的干擾明顯，無法進行含量測定，從而進行萃取，而正丁醇萃取宣痹洗劑中羥基紅花黃色素A的過程是利用羥基紅花黃色素A與雜質(zhì)在水與正丁醇2種互不相溶的溶劑中的溶解度或分配系數(shù)之間的差異，通過多次分配而實現(xiàn)分離[13]，而羥基紅花黃色素A在水飽和正丁醇中具有較大溶解度，所以本試驗用水飽和的正丁醇作為純化萃取的溶劑，具有純化效果好，操作簡便，用時短等優(yōu)點。且羥基紅花黃色素A是具有單查耳酮苷類結(jié)構(gòu)的化合物[14-15]，其分子結(jié)構(gòu)中具有不穩(wěn)定基團，在提取、分離、純化過程中易發(fā)生氧化、水解、聚合等反應，將使其結(jié)構(gòu)、藥理作用等發(fā)生變化[16]。

宣痹洗劑為北京中醫(yī)藥“十病十藥”入選項目，臨床效果顯著，但仍缺少相應質(zhì)量控制標準，尤其是對其中主成分的含量測定方法尚無相關(guān)研究，本研究對其中羥基紅花黃色素A的含量測定方法進行了研究，為該藥的質(zhì)量控制提供了理論參考。

[1]郭宇飛，申丹，楊洪軍.含紅花中藥組方規(guī)律分析[J].中國中醫(yī)雜志，2014，39（11）：2144-2148.

[2]姜華.羥基紅花黃色素A對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護作用及機制[J].中藥材，2013，36（3）：462-464.

[3]張國霞，王維波，陳德道，等.紅花中羥基紅花黃色素A的加速穩(wěn)定性研究[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（15）：86-88.

[4]何春龍，王煥蕓，莎日娜.HPLC法測定清熱八味散中羥基紅花黃色素A的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2014，28（1）：69-72.

[5]劉亮，杜江，姚麗，等.苗藥觀音草正丁醇萃取工藝的研究[J].中國民族民間醫(yī)藥，2011，20（20）：5-6.

[6]陳建平，王金輝，湯化琪，等.蒙藥瞿麥中多糖超聲提取工藝研究及含量測定[J].中南藥學，2013，11（4）：264-267.

[7]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：141.

[8]王煥蕓，馮欣，武娜.RP-HPLC測定七味葡萄散中羥基紅花黃色素A的含量[J].中國新藥雜志，2010，19（16）：1465-1467.

[9]楊紅，陳岳蓉，劉海青.RP-HPLC測定骨筋丸膠囊中羥基紅花黃色素A、落干酸和龍膽苦苷的含量[J].藥物分析雜志，2014，34（3）：423-427.

[10]張建業(yè)，陳星，孫云峰，等.RP-HPLC法同時測定新生化顆粒中羥基紅花黃色素A、阿魏酸和甘草酸銨[J].中成藥，2014，36（2）：310-313.

[11]趙國英，袁秀榮，李玲，等.鹿紅顆粒中黃芪甲苷和羥基紅花黃色素A的含量測定[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（6）：40-43.

[12]何梅鳳，吳偉，鄧新國，等.HPLC法測定兔房水中羥基紅花黃色素A[J].中成藥，2014，36（7）：1558-1560.

[13]丁越，張彤，陶建生，等.正丁醇萃取技術(shù)制備高純度梔子苷的工藝研究[J].中國新藥雜志，2012，21（14）：1596-1599.

[14]童文，孫佩，楊曉，等.紅花花色與羥基紅花黃色素A的相關(guān)性初探[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2011，24（1）：101-104. [15]唐紅，舒華，周文飛，等.紅花中羥基紅花黃色素A的純化工藝研究[J].廣州化工，2014，（15）：67-69，79.

[16]楊小虎，王丹丹，朱彥，等.羥基紅花黃色素A的現(xiàn)代研究新進展[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2013，33（3）：102-106.

Content determination of Hydroxy Safflor Yellow A in Xuanbi Lotion

TANGHuaqi1ZHANGZhiqian1WANGWenqi1LIDandan1XIAKun2SUShuang2WANGJinghong2SUNYikun1
1.School of Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China;2.Department of Pharmaceutical,Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100102,China

ObjectiveTo determine the content of Hydroxy Safflor Yellow A(HSYA)in Xuanbi Lotion.MethodsThe content of HSYA,measured by HPLC,was used as the evaluation index to determine the optimum N-butanol extraction condition by orthogonal experiment.ResultsThe content of HSYA in Xuanbi Lotion was 0.39μg/mL,the average recovery rate was 97.06%,RSD=1.4%(n=6),which was determined in the optimum extraction condition of 60 mL N-butanol,extracting for 4 times,shaking 50 s every time,and the effect order of the three factors was volume of N-butanol＞extraction times＞shaking time.ConclusionThe method of N-butanol extraction and content determination established by this study is convenient,rapid and precise,which can be used to control the quality of Xuanbi Lotion.

Xuanbi Lotion;Hydroxy Safflor Yellow A;N-butanol extraction;Content determination;HPLC

R284.2

A

1673-7210（2015）04（c）-0129-04

2015-01-19本文編輯：衛(wèi)軻）

北京中醫(yī)藥“十病十藥”研發(fā)項目（編號SBSY 2013-003）。

湯化琪（1992.11-），男，北京中醫(yī)藥大學2014級藥物分析專業(yè)在讀碩士研究生。

王景紅（1965.9-），女，主任藥師，中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院藥學部處長；研究方向：醫(yī)院藥學、臨床藥學、醫(yī)院制劑。孫毅坤（1965.1-），男，博士，教授，北京中醫(yī)藥大學中藥學院中藥分析系主任；研究方向：藥效物質(zhì)基礎及藥品質(zhì)量控制。