薛丹 黃奮奮 姚風(fēng)艷 孫連娜

1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海200433；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350108

中藥木瓜中總糖及還原糖的含量測定

薛丹1黃奮奮1姚風(fēng)艷2孫連娜1

1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海200433；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350108

目的建立中藥木瓜藥材中總糖及還原糖的測定方法并對其含量進(jìn)行測定，由此計算推測出藥材中多糖含量。方法采用苯酚-濃硫酸法測定總糖含量，采用3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）測定還原糖的含量。結(jié)果木瓜總糖含量為12.06%。DNS法測定還原糖的最佳條件為：測定波長560 nm，DNS最佳用量為5.0 mL，沸水浴加熱5 min。測得藥材中還原糖含量為11.58%。木瓜原藥材中多糖含量為2.51%。結(jié)論苯酚濃硫酸法及DNS法可用于總糖及還原糖含量的測定，總糖和還原糖含量的高低在一定程度上可以反映多糖含量的多少。

中藥木瓜；總糖；還原糖；苯酚-濃硫酸法；3，5-二硝基水楊酸法；含量測定

木瓜為薔薇科木瓜屬皺皮木瓜[Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai]的干燥近成熟果實，有舒筋活絡(luò)、和胃化濕之功效。用于濕痹拘攣、腰膝關(guān)節(jié)酸重疼痛、轉(zhuǎn)筋攣痛等癥狀[1]。木瓜全身是寶，營養(yǎng)成分較高，木瓜皮、花、枝、核和根都可開發(fā)利用。木瓜具有抗氧化、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗腹瀉等[2-7]。木瓜是我國傳統(tǒng)中藥中藥食同源的優(yōu)良產(chǎn)品。近年來，多糖作為一種生物活性大分子物質(zhì)，引起人們的廣泛關(guān)注。多糖的含量不能直接測得，總糖含量減去還原糖含量即為多糖含量[8-11]。有文獻(xiàn)采用苯酚濃硫酸法測定木瓜總糖含量[12]。目前，關(guān)于木瓜還原糖的含量測定報道較少且木瓜中還原糖含量測定的方法學(xué)考察也鮮有報道。還原糖的測定方法有多種[13]，本實驗采用苯酚濃硫酸法及3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）建立木瓜原藥材中總糖和還原糖的測定方法，并對其含量進(jìn)行測定。在此基礎(chǔ)上用總糖減去還原糖含量即可得到多糖含量，為木瓜多糖的質(zhì)量評價及開發(fā)利用提供一定的理論參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9145A型）；循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SENCO旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；PTHW型電熱套（河南豫華儀器有限公司）；LXJ-Ⅱ型離心沉淀機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠）；UV-5500PC型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 實驗試劑

葡萄糖（分析純，生工生物）；3，5-二硝基水楊酸（Adamas Reagent Co.，Ltd）；酒石酸鉀鈉四水合物（分析純，Shanghai Titanchem Co.，Ltd）；亞硫酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇（分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司）；95%乙醇（分析純，上海道君精細(xì)化工有限公司）。中藥木瓜藥材購于第二軍醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院上海長征醫(yī)院制劑室，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室張漢明教授鑒定為皺皮木瓜Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥成熟果實。標(biāo)本存于本實驗室。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

中藥木瓜藥材室溫晾干后，粉碎，過4號篩，稱取150 g，按液固比20∶1，即3000 mL水，在100℃沸水中回流提取3 h，放冷，紗布過濾。濾渣再次加入3000 mL水，沸水回流提取3 h，同樣方法重復(fù)提取2次。合并濾液，定容至1000 mL，作為測定總糖及還原糖的供試品溶液。

2.2 葡萄糖對照品溶液的制備

精密稱取烘干至恒重的葡萄糖對照品0.9984 g，以蒸餾水定容至1000 mL，配制成0.9984 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 6%苯酚溶液的配制

取適量苯酚，常壓蒸餾，收集180℃餾分。再精密稱取餾分80 g于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解至刻度。即得80%苯酚，保存于4℃冰箱備用。6%苯酚由80%苯酚現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.4 DNS試劑的配制

A液：水煮沸10 min冷卻后，稱取6.3 g DNS，21.0 g氫氧化鈉充分溶解于500 mL水中。B液：稱取182.0 g酒石酸鉀鈉溶解于500 mL熱水中，再加入5.0 g苯酚，5.0 g亞硫酸鈉，攪拌溶解。再將A液與B液混合均勻，定容至1000 mL棕色容量瓶中，于4℃冰箱中放置7 d[14]。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.5.1 總糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線精密移取0.9984 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于試管中，分別補(bǔ)蒸餾水至2.0 mL。以2.0 mL蒸餾水作空白對照，分別精密加入6%苯酚1.0 mL，搖勻后立即加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，70℃水浴中加熱20 min后冷卻10 min，于490 nm處檢測吸光度。以吸光度（A）為橫坐標(biāo)，濃度（C）為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程：C=0.0622 A+ 0.0006，r=0.9990。結(jié)果表明，葡萄糖濃度在0.009 58～0.057 48 g/L之間與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.2 還原糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線精密移取0.9984 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.3、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0 mL于試管中，分別補(bǔ)蒸餾水至2.0 mL?；靹蚝蠹尤隓NS 5.0 mL，沸水浴加熱5 min，冰水冷卻后至室溫后定容至25 mL。以蒸餾水為空白，于560 nm處測定吸光度，每組測定3次，取平均值。以葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)做圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A=11.818C-0.019，r=0.9993。結(jié)果表明，葡萄糖濃度在0.012～0.080 g/L之間與吸光度呈良好的線性關(guān)系。見圖2。

圖2 DNS法測定還原糖中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 測定條件的優(yōu)化考察

2.6.1 顯色條件的優(yōu)化中藥木瓜中總糖的含量測定多采用苯酚濃硫酸法[12]，本實驗采用6%苯酚1.0 mL、濃硫酸5.0 mL，沸水浴15 min，冷卻至室溫后于490 nm處測定吸光度值。而還原糖的顯色條件差異較大，故本實驗主要對中藥木瓜還原糖的最佳測定條件進(jìn)行考察[10]。

2.6.2 DNS最佳吸收波長的確定分別于葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、木瓜水提液、醇沉后的粗多糖液加入5.0 mL DNS試劑，沸水浴加熱5 min，放置20 min后在450～650 nm處掃描吸收光譜。由圖3～5可知，以DNS試劑為空白，還原產(chǎn)物在500 nm波長處有最大吸收，但吸收值為負(fù)值。而以DNS試劑為空白，在560 nm處可降低顯色劑的影響，最佳的工作波長為560 nm。以蒸餾水為空白，在560 nm處吸光度空白吸收不影響還原糖的測定?？紤]到DNS試劑的穩(wěn)定性因素，選擇以蒸餾水為空白，選取560 nm作為測定波長。

圖3 不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、木瓜藥材水提液與醇沉后多糖的波長掃描（以3，5-二硝基水楊酸為空白）

圖4 不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的波長掃描（以水為空白）

圖5 木瓜提取液與醇沉后多糖吸收波長的掃描（以水為空白）

2.6.3 沸水浴加熱時間的確定精密移取0.9984 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL及蒸餾水1.5 mL于試管中，分別加入5.0 mL DNS試劑，沸水浴加熱1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30 min，冰水冷卻至室溫后定容至25 mL，以蒸餾水為空白，于560 nm處測定吸光度。由圖6可知，隨著加熱時間增大，吸光度值隨之增大，在加熱時間為4 min時吸光度達(dá)到最大，之后維持穩(wěn)定，顯色反應(yīng)基本完成。從反應(yīng)完全及節(jié)省時間考慮選擇沸水浴加熱時間為5 min。

圖6 沸水浴加熱時間對吸光度值的影響

2.6.4 DNS用量的確定精密移取0.9984 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL及蒸餾水1.5 mL于試管中，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、6.5、7.0 mL DNS試劑，沸水浴加熱15 min，冰水冷卻至室溫后定容至25 mL容量瓶。以蒸餾水為空白，于560 nm處測定吸光度值。測得結(jié)果見圖7，吸光度隨著顯色劑用量的增加而增加，DNS用量在5.0 mL時吸光度基本趨于穩(wěn)定?？紤]到能耗與成本，因此確定DNS的最佳用量為5.0 mL。

圖7 3，5-二硝基水楊酸試劑用量對吸光度值的影響

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 精密度試驗分別精密移取0.9984 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1.0 mL及1.0 mL蒸餾水于試管中，混勻后分別加入DNS試劑5.0 mL，沸水浴加熱5 min，冰水冷卻，以蒸餾水為空白于560 nm處測定吸光度。日內(nèi)吸光度為0.198、0.200、0.201、0.198、0.198、0.196，n= 6，RSD=1.76%。日間精密度為0.203、0.201、0.202，n= 3，RSD=0.10%。提示儀器性能良好，操作準(zhǔn)確可靠。

2.7.2 還原產(chǎn)物的穩(wěn)定性試驗精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，加入1.0 mL蒸餾水及DNS試劑5.0 mL，沸水浴加熱5 min后冰水冷卻定容至25 mL。分別放置10、20、30、40、50、60 min。以蒸餾水為空白，于560 nm處吸光度為0.198、0.201、0.198、0.201、0.203、0.203，n=6，RSD=0.23%。實驗結(jié)果表明，顯色后60 min，吸光度值波動穩(wěn)定。

2.7.3 還原糖加樣回收試驗精密移取已知還原糖含量為0.3596 g/L 1.0 mL的樣品，按還原糖含量的80%、100%和120%精密加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后加入DNS試劑5.0 mL，沸水浴加熱5 min，冷卻后定容至25 mL，以蒸餾水為空白，于560 nm處測定吸光度。結(jié)果顯示，還原糖平均加樣回收率為99.03%，符合要求。見表1。

表1 還原糖加樣回收試驗

2.8 木瓜還原糖的測定

采用已建立的測定方法，測定總糖及還原糖含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用苯酚濃硫酸法測得木瓜藥材中總糖為14.09%，采用DNS法測得木瓜藥材中還原糖為11.58%，中藥木瓜藥材中多糖含量為2.51%。

3 討論

還原糖是具有還原性的糖，主要含有游離醛基及游離酮基，在堿性條件下加熱被氧化成糖酸，DNS被還原成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與顏色深淺成正比。所有的單糖和大部分雙糖都是還原糖。本實驗中還原糖的波長掃描采用了以蒸餾水和DNS試劑為空白，在最大吸收波長處，空白都有吸收，而在空白吸收最小時，還原糖的測定波長為560 nm。本實驗中采用以蒸餾水為空白，減少了因DNS試劑配制過程中的操作誤差，從而保證測定結(jié)果的穩(wěn)定性。

通過吸收波長、顯色時間及顯色劑用量等影響還原糖測定的因素進(jìn)行實驗考察，確定了木瓜還原糖含量測定的最佳波長為560 nm，沸水浴顯色時間5 min， DNS試劑用量為5 mL。

多糖是皺皮木瓜的有效成分之一，目前多糖無法直接測定?？偺桥c還原糖的多少在一定程度上反映了多糖的含量。本實驗采用苯酚濃硫酸測定總糖含量，采用DNS測定還原糖含量，兩者之差即為多糖含量。多糖是聚合結(jié)構(gòu)，不含醛基，不是還原糖。DNS法測得的為還原糖的含量，避免了單糖、雙糖、低聚糖及還原性物質(zhì)對多糖測定的干擾，使得多糖的測得結(jié)果更加接近準(zhǔn)確可靠。本實驗測得中藥木瓜藥材中多糖含量為2.51%。

作為藥食兩用的傳統(tǒng)果實部分藥材，含有還原糖[16]。常見的還原糖有葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、甘露三糖。單糖是碳水化合物中最基本的單位，是不能水解的糖類，無需消化就可直接吸收與利用，因此用單糖補(bǔ)充熱能比雙糖及多糖效果更快。本研究為中藥木瓜中多糖成分的提取分析、質(zhì)量評價提供新的參考，為進(jìn)一步的研究開發(fā)利用中藥木瓜提供理論依據(jù)。

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Determination of total sugar and reducing sugar in Chaenomeles speciosa

XUEDan1HUANGDoudou1YAOFengyan2SUNLianna1
1.Department of Pharmacy,the Second Military Medical University,Shanghai 200433,China;2.Department of Pharmacy,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fujian Province,Fuzhou 350108,China

ObjectiveTo establish a method for determination of total sugar and reducing sugar in Chaenomeles speciosa and to detect the content of sugar with the methods.MethodsThe content of total sugar was determined by phenol-sulfuric acid method.The concentration of reducing sugar was determined by 3,5-dinitrosalicylic acid method.ResultsThe content of total sugar in Chaenomeles speciosa was 12.06%.The optimum determination wavelength of DNS colorimetry was 560 nm.The proper volume of DNS sample was 5.0 mL.The best time for colour reaction in the condition of boiling water bath was kept for 5 min.The content of reducing sugar in Chaenomeles speciosa was 11.58%.The content of polysaccharides was 2.51%.ConclusionPhenol-sulfuric acid method and DNS method can be used for the determination of total sugar and reducing sugar.The content of total sugar and reducing sugar indicate the content of polysaccharides in some degree.

Chaenomeles speciosa;Total sugar;Reducing sugar;Phenol-sulfuric acid method;3,5-dinitrosalicylic acid method;Determination of content

R284.1

A

1673-7210（2015）04（c）-0121-05

2015-01-12本文編輯：衛(wèi)軻）

國家科技重大專項-重大新藥創(chuàng)制（編號2011ZX 09102-006）。

薛丹（1988.8-），女，第二軍醫(yī)大學(xué)2012級生藥學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：中藥有效成分的提取分離及鑒定。

孫連娜（1973.9-），女，博士，教授；研究方向：中藥鑒定與品質(zhì)評價。