徐剛 胡朝奇 白珺 陳新

1.蕪湖先聲中人藥業(yè)有限公司，安徽蕪湖241080；2.長春中醫(yī)藥大學藥學院，吉林長春130117

正交試驗優(yōu)選鹿茸胃內(nèi)仿生的提取工藝

徐剛1胡朝奇1白珺2陳新2

1.蕪湖先聲中人藥業(yè)有限公司，安徽蕪湖241080；2.長春中醫(yī)藥大學藥學院，吉林長春130117

目的建立鹿茸胃內(nèi)仿生提取的最優(yōu)工藝。方法以鹿茸細粉粒度、細粉與提取介質體積比、提取溫度、轉速、提取時間和提取次數(shù)作為試驗因素，采用正交試驗設計和單因素分析方法，以總氨基酸含量作為指標，進行鹿茸胃內(nèi)仿生提取最優(yōu)工藝研究。結果鹿茸胃內(nèi)仿生提取最優(yōu)工藝為：鹿茸細粉粒度100目，細粉與提取介質體積比1∶50，提取溫度37℃，轉速50 r/min，提取時間1 h，提取次數(shù)1次。結論鹿茸仿生提取工藝穩(wěn)定、可靠，初步實現(xiàn)了鹿茸在人體胃液中代謝過程，對鹿茸藥效物質的開發(fā)及應用具有重要的研究意義。

鹿茸曰胃內(nèi)曰仿生提取曰工藝研究

鹿茸（Cornu Cervi Pantotrichum）為鹿科動物梅花鹿Cervus nippon Temminck或馬鹿Cervus phus Linnaeus的雄性未骨化密生茸毛的幼角。中醫(yī)理論認為鹿茸具有“補腎陽、益精血、強筋骨、托瘡毒”之功效[1]，是滋補的上品，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)鹿茸中含有大量的粗蛋白，其在進入人體后被人體胃內(nèi)和腸內(nèi)的消化酶降解，進而生成氨基酸、多肽等功能物質[2]，從而發(fā)揮其藥效和保健作用，但是傳統(tǒng)的鹿茸有效物質的提取方法多為水提法或醇提法，無法體現(xiàn)鹿茸在人體內(nèi)的代謝過程，從而造成實驗結果不理想[3]。近年來隨著生物技術和代謝組學在中藥有效物質中的應用，中藥體內(nèi)代謝研究已經(jīng)成為中藥藥效物質研究的一個新的研究方向?；诖耍狙芯坎捎谜辉囼灧▽β谷左w外胃內(nèi)仿生提取進行了最優(yōu)工藝優(yōu)化，現(xiàn)將研究結果報道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科技有限公司），F(xiàn)A1204B電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司），ZRS-6G智能溶出實驗儀（天津天大天發(fā)有限公司），飛鴿LXJ-IIB低速大容量離心機（上海安亭科學儀器廠），SpectrumLab752s紫外分光光度計（上海棱光技術有限公司），RE-52A旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

甘氨酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：140689-201404），胃蛋白酶（中國惠世生化試劑有限公司，批號：120408），鹽酸（北京化工廠，批號：20061019），茚三酮（上海三愛思試劑有限公司，批號130808），無水磷酸二氫鈉（天津市光復精細化工研究所，批號：20101025），磷酸氫二鉀（北京化工廠，批號：20111103），水為蒸餾水。

鹿茸，由吉林吉春藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室主任姜大成教授鑒定為馬鹿茸（Cervus elaplus Linnaeus）。

2 方法與結果

2.1 總氨基酸的含量測定

2.1.1 甘氨酸標準液的制備精密稱取甘氨酸標準品4 mg，置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，即得80μg/mL的標準品溶液儲備液。

2.1.2 鹿茸仿生提取物溶液的制備精密稱取鹿茸細粉（80目）5 g，依據(jù)各工藝條件下工藝參數(shù)進行提取，提取結束后，離心（4800 r/min），取上清液，將上清液置于旋轉蒸發(fā)儀中，60℃減壓回收至適量，并定容至50 mL，過濾，即制成生藥量0.1 g/mL鹿茸仿生提取物溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備取鹿茸仿生提取物溶液2.5 mL，置于25 mL的容量瓶中，補加水5.00 mL，再分別加入磷酸鹽緩沖液和2%茚三酮各1 mL，搖勻。沸水浴加熱15 min，迅速用冷水冷卻至室溫，加蒸餾水稀釋至刻度，過濾，即得

2.1.4 對照品溶液的制備取甘氨酸標準品溶液2.5 mL置于25 mL的容量瓶中，補加水5.00 mL，再分別加入磷酸鹽緩沖液和2%茚三酮各1 mL，搖勻。沸水浴加熱15 min，迅速用冷水冷卻至室溫，加蒸餾水稀釋至刻度，過濾，即得

2.1.5 測定方法取1.00 mL蒸餾水置于25 mL量瓶中，按“2.1.3”項下供試品溶液制備方法制成空白溶液。在570 nm波長處以空白溶液為參比，測定供試品及對照品溶液吸光度A值，采用對照品比較法計算其總氨基酸含量[4]。

2.1.6 精密度考察依次量取等量供試品溶液和對照品溶液，按“2.1.5”項下測定方法分別連續(xù)進行6次A值測定，結果供試品溶液吸光度的相對標準偏差（RSD）為0.12%，對照品峰面積的RSD為0.11%，均小于2%，說明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性考察按照供試品/對照品溶液制備方法制備溶液，分別于供試品/對照品溶液制備后的0、5、10、15、20、30、45、60、90、120 min，按“2.1.5”項下測定方法，依次取供試品溶液/對照品溶液適量，測定其A值，結果供試品溶液峰面積的RSD為1.13%，對照品溶液峰面積的RSD為1.02%，均小于2%，說明在120 min內(nèi)供試品溶液和對照品溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復性考察按照“2.1.3”項下供試品溶液制備方法，分別制備6份供試品溶液，按照“2.1.5”項下測定方法，分別進行測定其A值，結果其RSD為2.46%，說明重復性良好。

2.1.9 線性關系考察分別吸取甘氨酸標準液1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mL置于25 mL的容量瓶中，按“2.1.4”項下對照品溶液制備方法依次制備不同濃度的對照品溶液，按“2.1.5”項下測定法分別測定其A值。分別以濃度（X）與吸光度（Y）為橫縱坐標，制作標準曲線，線性方程為Y=0.0594X+0.005，r=0.9999，說明對照品溶液在4.8～11.2μg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好線性關系。

2.1.10 加樣回收率試驗依次精密量取供試品溶液1.0、1.2、1.5 mL，置于25 mL量瓶中，精密量取10μg/mL甘氨酸標準品溶液0.7、0.9、1.1 mL，置于量瓶中，按“2.1.3”項下供試品溶液制備方法制備不同濃度回收率供試品溶液，每個濃度各制備3份，共計9份供試品，按“2.1.5”項下測定方法分別測定其A值，結果溶液平均回收率為98.60%，RSD為2.99%，說明該方法準確性良好。

2.2 仿生提取工藝的初篩

鹿茸細粉粒度（A）、鹿茸細粉與提取介質的體積比（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）、提取溫度（E）及轉速（F）可能會對鹿茸水煎液仿生提取的效果產(chǎn)生一定的影響，因此使用L8（27）正交試驗表對鹿茸提取工藝影響因素進行初步的篩選，因素水平見表1，正交試驗結果見表2。

表1 鹿茸最優(yōu)仿生提取工藝初步篩選因素水平表

由表2可知，因素B、因素C和因素D（即鹿茸細粉與提取介質體積比、提取時間、提取次數(shù)）對仿生提取實驗結果的影響較小，故在進一步最優(yōu)提取條件的篩選過程中，采用單因素分析對上述因素進行優(yōu)化篩選；因素A、因素E和因素F（即鹿茸細粉粒度、提取溫度和轉速）對仿生提取的實驗結果影響較為顯著，故在進一步最優(yōu)提取條件的篩選過程中，采用L9（34）正交試驗表對上述因素進行進一步的優(yōu)化篩選；同時初步確定仿生提取最優(yōu)工藝為：A2B1C2D1E2F2，即鹿茸細粉粒度為100目，鹿茸細粉與提取介質體積比為1∶100，提取時間為2 h，提取次數(shù)為1次，提取溫度為37℃，轉速為75 r/min。

表2 正交試驗結果綜合評價直觀分析結果

2.3 仿生提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 鹿茸細粉與提取介質體積比的篩選依次取100目鹿茸細粉3份，每份2 g，分別加入50、100、200 mL的提取介質，按“2.2”項下仿生提取初步最優(yōu)工藝A2C2D1E2F2依次進行仿生提取處理，以氨基酸總量作為指標，采用單因素分析進行最優(yōu)鹿茸細粉與提取介質體積比的篩選。最優(yōu)鹿茸細粉與提取介質體積比篩選結果見表3。

表3 最優(yōu)鹿茸細粉與提取介質體積比單因素分析結果

分析表3結果可知，鹿茸細粉與提取介質體積比為1∶50及1∶100，其氨基酸含量明顯高于1∶25，且1∶50與1∶100所得產(chǎn)物中的氨基酸含量無顯著差異，故從實際實驗效率角度考慮，故選擇1∶50作為鹿茸仿生提取最優(yōu)鹿茸細粉與提取介質體積比。

2.3.2 提取時間的篩選依次取100目鹿茸細粉3份，每份2 g，分別依次加入100 mL的提取介質，按“2.2”項下仿生提取初步最優(yōu)工藝A2B1D1E2F2依次進行1.0、1.5、2.0 h的仿生提取處理，以氨基酸含量作為指標，采用單因素分析進行最優(yōu)仿生提取時間的篩選。最優(yōu)仿生提取時間的篩選的結果見表4。

表4 最優(yōu)仿生提取時間單因素分析結果

分析表4結果可知，1.0、1.5、2.0 h鹿茸仿生提取物的氨基酸含量無明顯差異，從實驗效率角度進行考慮，選擇1.0 h作為最優(yōu)仿生提取時間。

2.3.3 提取次數(shù)的篩選依次取100目鹿茸細粉3份，每份2 g，分別依次加入100 mL的提取介質，按“2.2”項下仿生提取初步最優(yōu)工藝A2B1C2E2F2進行仿生提取，依次提取1、2、3次，以氨基酸含量作為指標，采用單因素分析進行最優(yōu)提取次數(shù)。最優(yōu)提取次數(shù)篩選的結果見表5。

表5 最優(yōu)提取次數(shù)單因素分析結果

分析表5結果可知，3組仿生提取產(chǎn)物氨基酸含量無明顯差異，故從實驗效率角度考慮，選擇1次作為鹿茸仿生提取最優(yōu)提取次數(shù)。

2.3.4 最優(yōu)鹿茸細粉粒度、提取溫度和轉速的篩選依次按照L9（34）正交試驗表中工藝參數(shù)進行仿生提取，以總氨基酸含量作為指標，因素水平見表6，直觀分析見表7，方差分析見表8。

表6 L9（34）正交試驗因素水平表

表7 L9（34）正交試驗直觀分析結果

表8 正交試驗結果綜合評價的方差分析

由方差分析結果可知，因素A（鹿茸細粉粒度）和因素E（溫度）對提取物的氨基酸含量具有顯著影響（P＜0.05），因素F（轉速）對提取物的氨基酸含量無顯著影響，結合直觀分析結果，得出最優(yōu)提取工藝為A2E2F1，即鹿茸細粉100目，提取溫度為37℃，轉速為50 r/min。

2.4 驗證性實驗

為檢驗實驗結果的可靠性，采用上述工藝參數(shù)進行鹿茸仿生提取實驗進行3次平行實驗，3批驗證實驗總氨基酸含量均值為7.43μg/mL，RSD=2.17%，說明工藝穩(wěn)定、可靠。

2.5 結果

最優(yōu)鹿茸仿生提取工藝為：鹿茸細粉粒度為100目，鹿茸細粉與提取介質體積比為1∶50，在37℃溫度下，轉速50 r/min，提取1 h，提取1次，且工藝穩(wěn)定、可靠。

3 討論

隨著現(xiàn)代人們健康意識的加強，功能保健產(chǎn)品的市場份額越來越大，中藥作為我國傳統(tǒng)藥物，在我國有著2000多年的用藥歷史，同時也證明了中藥療效的確切，近些年來以傳統(tǒng)中藥為基礎，開發(fā)功能保健產(chǎn)品已成為中藥開發(fā)的另一個方向，一些名貴的中藥材如人參、冬蟲夏草等均已開發(fā)出多種保健食品[5]。鹿茸作為我國傳統(tǒng)的名貴中藥，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸中含有豐富的粗蛋白[6]，這些粗蛋白進入人體之后，會被消化酶降解生成多肽和氨基酸，具有良好的調節(jié)機體免疫力作用[7]，目前也是中藥保健食品的開發(fā)焦點藥物之一，雖然市場上有一些鹿茸的保健食品，但是其有效物質提取方法基本上都是沿用傳統(tǒng)的水提法或醇提法[8]，忽視了鹿茸在人體內(nèi)的代謝過程，因而其功能保健作用并不是十分理想。隨著代謝組學和生物技術等新興學科的應用，體內(nèi)代謝研究已成為藥物研究的必然方向?；凇斑€原論”的思維體系，為了進一步的模擬中藥在人體內(nèi)的代謝轉化過程，建立了中藥仿生提取理論，即以中藥粗提物或部位作為底物，添加至一定量的仿生溶媒（人工胃液、腸液）體系中，在溫和的條件下，動態(tài)地進行培養(yǎng)，使水煎液中的化學成分與仿生溶媒中的生物酶進行相互作用，從而模擬中藥水煎液在人體內(nèi)的轉化、吸收過程[9]。鑒于鹿茸中粗蛋白成分較多，且進入人體后將被分解生成氨基酸，本次實驗研究以總氨基酸含量作為含量測定指標。

正交試驗設計和單因素分析方法已在中藥有效物質提取工藝優(yōu)化中應用多年[10-11]，其可有效提高實驗效率，傳統(tǒng)的工藝優(yōu)化多在單因素分析的基礎上開展正交試驗設計[12]，其多建立在傳統(tǒng)提取工藝的基礎上，從而人為地將非關鍵因素進行單因素分析、關鍵因素進行正交試驗設計，存在一定的主觀性[13-14]。本次實驗研究所建立的鹿茸體外胃內(nèi)仿生提取工藝為一種新型的提取工藝，無傳統(tǒng)提取工藝基礎，因此本次實驗針對提取過程中的工藝參數(shù)先采用L8（27）正交試驗對工藝參數(shù)進行初篩，通過統(tǒng)計分析，對整體工藝有較大影響因素的參數(shù)進一步進行正交試驗設計，無明顯影響的因素進行單因素分析，從而有效提高了整體工藝設計的科學性和客觀性，避免了人為經(jīng)驗對實驗結果造成的影響；同時使用智能溶出儀模擬人體胃環(huán)境，采用人工胃液作為提取溶液，模擬人體胃環(huán)境溫度，有效模擬了鹿茸在在人體內(nèi)的代謝過程，并基于此獲得了鹿茸最優(yōu)仿生提取工藝，為鹿茸體外代謝研究和相關功能保健食品的開發(fā)奠定了實驗基礎。

中藥仿生提取研究基于人體代謝模型，通過使用人工消化液對中藥進行提取，相當于藥物在體外進行“預消化”處理，可能提高中藥的生物利用度，改善中藥生物利用度低下的弊端[15]；同時通過人體消化液與中藥中有效成分發(fā)生化學作用，可以豐富有效物質化合物結構庫，為中藥有效物質的篩選提供幫助。雖然目前中藥放生提取仍處于起始階段，但是隨著相關學科的發(fā)展，中藥仿生提取將成為中藥藥效物質研究的一種新方法，為中藥有效物質的開發(fā)及應用作出巨大貢獻。

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Optimization of processing technology for Cornu Cervi Pantotrichum stomach bionic extraction in vitro by orthogonal test

XUGang1HUChaoqi1BAIJun2CHENXin2
1.Wuhu Simcere Sino-implant Pharmaceutical Co.Ltd.,Anhui Province,Wuhu 241080,China;2.School of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Jilin Province,Changchun 130117,China

ObjectiveTo develop the optimum process of Cornu Cervi Pantotrichum stomach bionic extraction in vitro.MethodsCornu Cervi Pantotrichum powder particle size,volume ratio of Cornu Cervi Pantotrichum powder with extraction medium,extraction temperature,speed,extraction time,frequency were used as factors,and the total content of amino acid in Cornu Cervi Pantotrichum was used as index.The orthogonal test and single factor analysis methods to develop the optimum process of Cornu Cervi Pantotrichum stomach bionic extraction was used in vitro.ResultsThe optimum process:Cornu Cervi Pantotrichum powder particle size was 100 mesh,volume ratio of Cornu Cervi Pantotrichum powder with extraction medium was 1∶50,temperature was 37℃,speed was 50 r/min,extraction time was 1 h,frequency was 1.ConclusionThe optimum process of Cornu Cervi Pantotrichum stomach bionic extraction in vitro is stable and reliable.It realizes the metabolism process for Cornu Cervi Pantotrichum in human gastric juice preliminarily and does important significance for the development and application of effective substance in Cornu Cervi Pantotrichum.

Cornu Cervi Pantotrichum;Stomach;Bionic extraction;Process optimization

R284

A

1673-7210（2015）04（c）-0021-05

2015-01-17本文編輯：衛(wèi)軻）

吉林省中醫(yī)藥管理局項目中醫(yī)藥科技項目（編號2010-pt011）。

徐剛（1971.10-），男，碩士研究生，蕪湖先聲中人藥業(yè)有限公司總經(jīng)理、技術中心主任；研究方向：藥物制劑和質量標準研究。

陳新（1965.5-），女，教授，長春中醫(yī)藥大學中藥化學教研室主任；研究方向：中藥藥效物質基礎開發(fā)與利用。