段和祥 黃宇枚 王棟 楊毅生 程奇珍 羅文艷

1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西南昌330029；

2.南昌大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330029；3.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院藥劑科，江西南昌330003

蔞蒿抗腫瘤作用活性部位的篩選

段和祥1黃宇枚2王棟1楊毅生1程奇珍1羅文艷3

1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西南昌330029；

2.南昌大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330029；3.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院藥劑科，江西南昌330003

目的采用體內(nèi)外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)方法，篩選蔞蒿抗腫瘤活性部位。方法以95%乙醇提取，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇提取，得不同的提取層。用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法篩選出對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG2）細(xì)胞有良好增殖抑制作用的活性部位，并通過荷瘤小鼠模型考察活性部位對(duì)實(shí)體瘤生長的影響。結(jié)果蔞蒿的乙酸乙酯層對(duì)細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，在10 g/L濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖抑制率為15.64%，當(dāng)濃度為1000 g/L時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)78.21%，其作用隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。蔞蒿的乙酸乙酯層也對(duì)荷瘤小鼠有顯著的抑制作用，當(dāng)濃度為400 mg/kg時(shí)，對(duì)小鼠HepG2肉瘤的抑瘤率達(dá)71.63%。結(jié)論蔞蒿的乙酸乙酯層具有顯著的體內(nèi)、外抗腫瘤活性。

蔞蒿曰抗腫瘤曰活性部位

腫瘤是以細(xì)胞異常增殖為特點(diǎn)的一類疾病，常在機(jī)體局部形成腫塊。腫瘤的種類繁多，且具有不同的生物學(xué)行為和臨床表現(xiàn)。有些腫瘤生長迅速，侵襲力強(qiáng)，可從原發(fā)部位擴(kuò)散到身體其他部位，嚴(yán)重影響機(jī)體健康，我們稱之為惡性腫瘤，俗稱癌癥。它所帶來的醫(yī)療費(fèi)用及對(duì)患者和親屬產(chǎn)生的心理壓力也是巨大的，是目前全球居民死亡率最高的疾病之一。

蔞蒿（Artemisia Selengensis Turcz.ex Bess.）為菊科蒿屬植物，別名蘆、蒿、蘆蒿、水蒿、荑蒿等[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將蔞蒿列為上品[2]，《本草綱目》將其收于草部第15卷[3]，為多年生草本植物，全草入藥，性平、味甘，有止血消炎、鎮(zhèn)咳化痰、開胃健脾、散寒除濕等功效。沈夕坤等[4]藥理研究表明，蔞蒿可增強(qiáng)小鼠抗缺氧、抗疲勞、耐高溫、耐低溫能力，有較好的補(bǔ)益和免疫促進(jìn)作用。張健等[5]從萎蒿葉中首次分離得到化合物11，13-dihydroatricarin，發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)B-16細(xì)胞（小鼠黑色素瘤細(xì)胞）和HL-60細(xì)胞（人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞）有顯著的抑制活性，在濃度為1×10-5mol/L時(shí)，抑瘤率均到達(dá)90%以上，并且隨著濃度的遞減，抑制作用也逐漸減弱。蔞蒿對(duì)痢疾桿菌、大腸埃希菌、巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和多種真菌也均有良好的抑制作用[6]。目前關(guān)于蔞蒿的研究，主要集中在抗菌、抗氧化、降壓等活性物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理活性方面[7-13]，但蔞蒿抗腫瘤之功效，并未引起人們的足夠重視。本試驗(yàn)對(duì)蔞蒿抗腫瘤的活性部位進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步篩選蔞蒿中抗腫瘤活性成分提供重要依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社），AL104電子天平（梅特勒-托利多公司），NAPCO（美國Costar公司），VD53真空干燥箱（德國BIND公司），Synergguv超純水儀（法國Millipore公司），KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司），ST16R低溫離心機(jī)（ThermoFishier公司）。

1.2 材料

蔞蒿采自江西省九江市鄱陽湖畔，經(jīng)江西省食品藥品檢驗(yàn)所袁桂平主任中藥師鑒定為菊科蒿屬植物蔞蒿的全草。胰蛋白酶（中國食品藥品檢定所，批號(hào)：615-9605），小牛血清（杭州四季青生物材料有限公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基（GIBCO）；二甲基亞砜（DMSO）、5-氟胞嘧啶（5-Fu）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、環(huán)磷酰胺（CTX）均購于Sigma公司，其他所用試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞來源于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與醫(yī)學(xué)輻射學(xué)研究所，于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，在含有10%新生牛血（不含抗生素）的改良Eagle培養(yǎng)基（DMEN）培養(yǎng)基中生長，每3～4天以0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用小鼠為SPF級(jí)昆明（KM）小鼠，雌雄各半，3～4周齡，體重18～22 g，動(dòng)物合格證號(hào)：4300470 0005991，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

2 方法

2.1 樣品的制備

稱取鮮蔞蒿36 kg，切碎，晾干，得22 kg，加95%乙醇100 kg，回流提取2 h，放出回流液，藥渣再用95%乙醇100 kg，回流提取1.5 h，放出回流液，濾過，合并濾液，回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.05的流浸膏5 kg，加適量的水搖勻，得總提取物。該總提取物分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯與水飽和正丁醇提取，合并提取液，回收溶劑，依次得到石油醚層（85 g）、氯仿層（143 g）、乙酸乙酯層（261 g）和正丁醇層（776 g），備用。臨用前再用二甲基亞砜分別稀釋成10、100、1000 g/L。

2.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

采用MTT法，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞稀釋成1×104cells/mL，立即接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔100μL，然后在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)孔中加入不同濃度的樣品培養(yǎng)基，每個(gè)平行3孔，對(duì)照組（5-Fu）加等體積溶劑，置37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，然后以3000 r/min速度離心5 min，每孔加0.2 mL新鮮配制的含有0.2 mL MTT的無血清培養(yǎng)基，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再離心，倒出上清液，加0.2 mL二甲基亞砜溶解MTT甲臜沉淀，超聲5 min，混勻，在酶標(biāo)儀上于570 nm的波長處測定吸光度（A）。按（1-A樣品組/A對(duì)照組）× 100%計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

2.3 抗腫瘤活性體內(nèi)試驗(yàn)

選用體重18～22 g的KM小鼠50只和生長良好的HepG2細(xì)胞，將HepG2細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于小鼠右側(cè)腋部皮下，約5×106個(gè)細(xì)胞/只。隨機(jī)分成5組，每組10只，接種24 h后開始給藥。其中，乙酸乙酯層高、中、低劑量組（100、200、400 mg/kg），每日灌胃給藥1次，共14次；環(huán)磷酰胺（CTX）陽性對(duì)照組腹腔注射給藥（30 mg/kg），第1、8天給藥，共給藥2次；另設(shè)空白對(duì)照組，給予等體積生理鹽水。停藥后24 h處死動(dòng)物，稱體重、瘤重，計(jì)算各組平均瘤重。按下列公式計(jì)算腫瘤抑制率：抑瘤率=（1-治療組平均瘤重/空白對(duì)照組平均瘤重）×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 蔞蒿不同提取層對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用

結(jié)果表明，四種提取層對(duì)HepG2細(xì)胞增殖均有一定程度的抑制作用，其中，乙酸乙酯層的抑制作用最強(qiáng)，并且隨著濃度的遞增，抑制作用也逐漸增強(qiáng)，提示蔞蒿的乙酸乙酯層對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。見表1。

3.2 乙酸乙酯層的抑瘤作用

結(jié)果表明，乙酸乙酯層表現(xiàn)出較強(qiáng)的腫瘤抑制作用，并且隨著給藥劑量的增加，瘤重逐漸下降，說明抑瘤率顯著增強(qiáng)。再次確定了乙酸乙酯層為抗腫瘤的有效部位。見表2。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)蔞蒿4種提取層進(jìn)行了體外抗腫瘤細(xì)胞毒性試驗(yàn)，篩選出對(duì)HepG2有較好的細(xì)胞增殖抑制作用的有效部位。結(jié)果，乙酸乙酯層在1000 g/L時(shí)細(xì)胞增殖抑制率可達(dá)78.21%，說明乙酸乙酯層為其有效部位。石油醚層、氯仿層、水飽和正丁醇層對(duì)HepG2細(xì)胞增殖也有一定的抑制作用。體內(nèi)抗腫瘤結(jié)果顯示，乙酸乙酯層在100 mg/kg對(duì)小鼠HepG2肉瘤的抑制率為37.21%；當(dāng)濃度增至400 mg/kg時(shí)，抑瘤率高達(dá)71.63%，說明乙酸乙酯層對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，并對(duì)小鼠移植性HepG2瘤有較強(qiáng)的抑制作用，隨著給藥劑量的增加，瘤重逐漸下降，抑瘤率明顯升高。

表1 不同提取層細(xì)胞增殖抑制率比較

表2 乙酸乙酯層對(duì)小鼠HepG2肉瘤的抑制作用（x±s，n=10）

抗腫瘤藥物也是臨床藥物治療中使用量較大的一類，在所有類別藥物的不良反應(yīng)中抗腫瘤藥物不良反應(yīng)報(bào)告占了很大比例[14]。尋找天然抗腫瘤活性成分是抗癌藥物研究的一個(gè)重要途徑，天然藥物單體聯(lián)合西藥化療治療腫瘤疾病是又一重要途徑[15]，利用這些天然活性物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化，提高活性強(qiáng)度和選擇性，改善物理化學(xué)性質(zhì)和代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，是另一重要途徑[16-17]。

鑒于蒿屬植物在抗腫瘤方面的廣泛研究與應(yīng)用[18-28]，對(duì)蔞蒿抗腫瘤活性層進(jìn)行分離、純化及結(jié)構(gòu)鑒定，再進(jìn)行體外、體內(nèi)試驗(yàn)，比較活性成分與抗腫瘤作用二者之間的量效和構(gòu)效關(guān)系，為最終闡明蔞蒿的抗腫瘤活性化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，得到一系列抗腫瘤活性的活性成分，同時(shí)為研究和開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效低毒抗腫瘤藥奠定基礎(chǔ)。

[1]江紀(jì)武.拉漢藥用植物名稱和檢索手冊(cè)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1988：135.

[2]清·黃輯.神農(nóng)本草經(jīng)[M].北京：中醫(yī)古籍出版社，1982：57.

[3]明·李時(shí)珍.本草綱目[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1985：948.

[4]沈夕坤，王玳珠，江國榮.蔞蒿藥理作用的初步研究[J].藥學(xué)進(jìn)展，1999，23（1）：41-43.

[5]張健，孔令義.蔞蒿葉的化學(xué)成分研究[J].中國藥學(xué)雜志，2005，40（23）：1778-1780.

[6]鄭功源，陳紅兵，鄧丹雯，等.藜蒿提取物抑菌作用的初步研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1999，11（3）：72-76.

[7]Lu Zhang，Zong-cai Tu，Tao Yuan，et al.Solvent optimization，antioxidant activity，and chemical characterization of extracts from Artemisia selengnesis Turcz[J].Industrial Crops and Products，2014，56（5）：223-230.

[8]Sandra GF，Paula C.Antioxidant potential of Artemisia argentea L'Hér alcoholic extract and its relation with the phenolic composition[J].Food Research International，2011，44（6）：1620-1631.

[9]宇宙，胡居吾，付俊鶴，等.野生藜蒿提取物降壓作用研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31（6）：306-309.

[10]李曉明，劉躍鈞，鄧榮華，等.蘆蒿不同部位清除自由基活性研究[J].食品與機(jī)械，2012，28（9）：116-119.

[11]Chen Ze-yu，Li Shui-qing，Liu Yun.Microwave-assisted Extraction and Biological Activity Determination of Insecticidal Components of SelengWormwood（Artemisia selengensis Turcz.）[J].Plant Diseases and Pests，2010，1（6）：51-53，57.

[12]辛欣，余宙，范青生，等.藜蒿三萜分離純化及其體外抗氧化、抗菌活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21（2）：312-318.

[13]涂宗財(cái)，張露，王輝，等.超聲波輔助提取藜蒿多酚工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科學(xué)，2012，33（5）：239-242.

[14]鄭瑜，鄭瀅，林靜容，等.我院抗腫瘤藥物不良反應(yīng)報(bào)告分析[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，7（34）：110-113.

[15]陶亞玲，徐立春.天然藥物單體聯(lián)合西藥抑制消化道腫瘤的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11（6）：167-169.

[16]郭宗儒.天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)改造[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47（2）：144-157.

[17]郭穎，郭宗儒.個(gè)性化操作：天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)改造[J].中國新藥雜志，2014，23（7）：753-758.

[18]王可，周南進(jìn)，黃穎麗，等.槲皮素和藜蒿對(duì)腫瘤細(xì)胞生長抑制的初步研究[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，52（8）：10-15.

[19]Seo Hyo-Joung，Surh Young-Joon.Eupatilin，a pharmacologically active flavone derived from Artemisia plants，inducesapoptosisin human promyelocytic leukemia cells[J].Mutation research，2001，496（1-2）：191-198.

[20]Shi Feng，Jia Xiaobin，Zhao Chenglei，et al.Antioxidant activities of various extracts from Artemisisa selengensis Turcz（LuHao）[J].Molecules，2010，15：4934-4946.

[21]Kim Min-Jung，Kim Do-Hee，Na Hye-kyung，et al.E-upatilin，a pharmacologically active flavone derived from Artemisia plants，induces apoptosis in human gastric cancer（AGS）cells[J].Journal of environmental pathology toxicology and oncology，2005，24（4）：261-269.

[22]Jeong MA，Lee Ki Won，Yoon Do-Young，et al.Jaceosidin，a pharmacologically active flavone derived from Artemisia argyi，inhibits phorbol-ester-induced upregulation of COX-2 and MMP-9 by blocking phosphorylation of ERK-1 and-2 in cultured human mammary epithelial cells[J].Annals of the New York academy of sciences，2007，1095：458-466.

[23]Lee Hee-Gu，Yu Kyung-Ae，Oh Won-Keun，et al.Inhibitory effect of jaceosidin isolated from Artemisia argyi on the function of E6 and E7 on coproteins of HPV 16[J]. Journal of ethnopharmacology，2005，98（3）：339-343.

[24]Eunjeong Choi，Heesook Park，Jehyuk Lee，et al.Anticancer，antiobesity，and anti-inflammatory activity of Artemisia species in vitro[J].Journal of Traditional Chinese Medicine，2013，33（1）：92-97.

[25]Eunjeong Choi，Gunhee Kim.Effect of Artemisia species on cellular proliferation and apoptosis in human breast cancer cells via estrogen receptor-related pathway[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine，2013，33（5）：658-663.

[26]Xiaoli Bao，Huihui Yuan，Chengzhong Wang，et al. Antitumor and immunomodulatory activities of a polysaccharide from Artemisia argyi[J].Carbohydrate Polymers，2013，98（1）：1236-1243.

[27]Ji-Hyun Kim，Seung-Hyun Jung，Yeong-In Yang，et al.Artemisia leaf extract induces apoptosis in human endometriotic cells through regulation of the p38 and NFκB pathways[J].Journal of Ethnopharmacology，2013，145（3）：767-775.

[28]Daycem Khlifi，Rabiaa Manel Sghaier，Sameh Amouri，et al.Composition and anti-oxidant，anti-cancer and anti-inflammatory activities of Artemisia herba-alba，Ruta chalpensis L.and Peganum harmala L.[J].Food and Chemical Toxicology，2013，55（5）：202-208.

Screening of antitumor active fractions from Artemisia Selengensis Turcz.

DUANHexiang1HUANGYumei2WANGDong1YANGYisheng1CHENGQizhen1LUOWenyan3
1.Jiangxi Institute for Drug Control,Jiangxi Provincial Engineering Research Center for Drug and Medical Device Quality,Jiangxi Province,Nanchang 330029,China;2.College of Science and Technology,Nanchang University,Jiangxi Province,Nanchang 330029,China;3.Department of Pharmacy,the Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University, Jiangxi Province,Nanchang 330003,China

ObjectiveTo screen the antitumor active fraction from Artemisia selengensis Turcz.by antitumor experimental method in vitro and in vivo.MethodsArtemisia selengensis Turcz.were extracted with 95%ethanol eluent, then petroleum ether,chloroform,ethyl acetate,n-butyl alcohol extracted from the active fraction.The active fraction of good inhibitory effect on HepG2 cells proliferation was screened out by MTT assay.The inhibition effect of solid tumor by tumor-bearing mouse model was investigated.ResultsEthyl acetate extract of Artemisia selengensis Turcz.could significantly inhibit the growth for cell proliferation,the inhibition rate was 15.64%at 10 g/L.The inhibition rate was 78.21%at 1000 g/L.With the increase of the concentration,inhibiting action increased.Ethyl acetate extract of Artemisia selengensis Turcz.significant inhibition effect of solid tumor.When the concentration of 400 mg/kg for tumor bearing mouse inhibition rate was 71.63%.ConclusionEthyl acetate extract of Artemisia selengensis Turcz.has significant anti-tumor activity in vitro and in vivo.

Artemisia Selengensis Turcz.;Antitumor;Active fraction

R284.1

A

1673-7210（2015）04（c）-0013-04

2015-01-21本文編輯：衛(wèi)軻）

江西省青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)20122BAB 215044）；江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)指導(dǎo)性計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)2013B014）。

段和祥（1980.5-），男，碩士研究生；研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

羅文艷（1980.5-），女，碩士研究生；研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。