易凌霄，陳智勇，董 偉

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國際學(xué)院，湖南 長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙410128）

一種新型抗菌活性物質(zhì)的初步研究

易凌霄1，陳智勇2，董 偉3

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國際學(xué)院，湖南 長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙410128）

應(yīng)用高速離心和高效液相色譜法分離純化技術(shù)，從大腸桿菌細胞裂解液中獲得了一種新型的天然抗菌活性物質(zhì)。體外抑菌試驗結(jié)果顯示：該活性物質(zhì)對金色葡萄球菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、青枯病菌的最小抑菌濃度（MI C） 分別為2.5μg/m l、5μg/m l、0.625μg/m l、0.625μg/ml、1.25μg/ml，最低殺菌濃度（M B C）分別為5μg/ml、5μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、2.5μg/ml；化學(xué)法和質(zhì)譜法進行成分鑒定的結(jié)果證明該抗菌活性物質(zhì)為生物堿；對模式植物擬南芥的安全性評價結(jié)果顯示該抗菌活性物質(zhì)對植物的生長發(fā)育無抑制作用和不良影響。上述實驗結(jié)果表明：該抗菌活性物質(zhì)是一種廣譜、高效、安全的新型抗菌天然產(chǎn)物，具有可替代抗生素類藥物的開發(fā)利用前景。

抗菌活性物質(zhì)；生物堿；大腸桿菌；青枯??；擬南芥

細菌病害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要災(zāi)害之一，常給動物養(yǎng)殖和植物栽培帶來極大的損失。目前生產(chǎn)上對細菌性病害的防治主要依靠抗生素類藥物。由于抗生素類藥物的大量長期使用，導(dǎo)致了耐藥性細菌甚至超級細菌的出現(xiàn)，給動植物細菌病的防治帶來了嚴重挑戰(zhàn)[1]。因此，開發(fā)新的抗菌藥物，突破抗生素耐藥性難題，已成為當前世界關(guān)注的焦點和研究的熱點。

從動植物和微生物中提取天然抗菌活性物質(zhì)是尋找新型抗菌藥物的重要途徑，因為天然抗菌活性物質(zhì)具有高效、低毒、無污染和來源廣等特點，可有效抑制細菌生長，同時也不會對環(huán)境造成污染，或?qū)е庐a(chǎn)生抗藥性，而且生產(chǎn)方便、研發(fā)周期短[2]。近年來，已有不少學(xué)者從多種生物體內(nèi)分離提取到了天然的抗菌活性物質(zhì)[3-8]，但還未見從大腸桿菌中分離提取天然抗菌活性物質(zhì)的研究報道。大腸桿菌是常用的實驗細菌，來源廣泛，易于培養(yǎng)，而且遺傳背景清楚，如能從大腸桿菌細胞中分離提取到天然的抗菌活性物質(zhì)，將有重要的理論研究意義。

另外，在已有的關(guān)于天然抗菌活性物質(zhì)的報道中，還沒有涉及到對植物青枯病菌防治的研究。實際上，在作物栽培生產(chǎn)中，青枯病的危害是相當嚴重的，由Ralstonia solanacearum(Sm ith)Yabuuchi引起的植物細菌性青枯病在熱帶和亞熱帶地區(qū)普遍發(fā)生，是世界上危害最大、分布最廣、造成損失最嚴重的植物土傳病害之一，而目前對青枯病的防治方法仍然主要是使用抗生素[9-12]。因此，研發(fā)出抗植物青枯病的天然的抗菌活性物質(zhì)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著極為重要的應(yīng)用價值。

試驗選擇大腸桿菌為天然抗菌活性物質(zhì)的供體材料，用堿裂解法裂解大腸桿菌細胞，通過高速離心和高效液相色譜分離純化細胞內(nèi)容物，進行體外抑菌試驗，篩選抗菌天然活性物質(zhì)，并用化學(xué)法和質(zhì)譜法對其成分進行鑒定，對抗菌活性物質(zhì)進行安全性評價，旨在獲得一種在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有應(yīng)用價值，特別是對植物青枯病有良好防治效果的新型天然抗菌活性物質(zhì)，以替代目前仍在大量使用的抗生素類藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 大腸桿菌 (E.coli)C44103；鏈 球菌(streptococcus)O1026；巴氏桿菌(pasteurellamultocid) C44-1；金葡菌(staphylococcus aureus)C26112，購自中國獸藥監(jiān)察所，并由實驗室保存。青枯病菌種由王國梁教授惠贈。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 LB培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、乙腈、濃硫酸、茚三酮、碘-碘化鉀、苦味酸、磷鉬酸試劑﹑硅鎢酸試劑、碘化汞鉀試劑、碳酸鈉、乙醚、硝酸銀的氨溶液、蘇丹Ⅳ溶液。配置以上培養(yǎng)基和溶液的試劑均為國產(chǎn)分析純，以上培養(yǎng)基和溶液均由實驗室配置并保存。Wst-1染液（冷凍避光保存）。

1.1.3 植物種子 模式植物擬南芥野生型種子由夏石頭教授惠贈。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗菌活性物質(zhì)的分離與篩選 （1）大腸桿菌的培養(yǎng)：在無菌操作臺上取大腸桿菌實驗菌株單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中震動培養(yǎng)24 h。（2）大腸桿菌細胞裂解：參考江歡歡的方法[13]進行，并作一定調(diào)整。（3）大腸桿菌細胞裂解物的分級離心：取大腸桿菌細胞裂解液，用1000 r/m in、2000 r/m in、3 000 r/m in、4 000 r/m in、4 000 r/m in、5 000 r/m in、6 000 r/m in、7 000 r/m in、8 000 r/m in、9 000 r/m in、10 000 r/m in的10個梯度，分別離心15m in，同時分別收集各離心梯度的沉淀。（4）抗菌活性成分的篩選：采用MTT方法測定各級離心沉淀的抗菌活性。將各級離心沉淀分別置于50℃下烘干，將大腸桿菌標準菌株培養(yǎng)后進行活菌計數(shù)，并稀釋至106個/m L；取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入100μL的稀釋菌液，在加了菌液的孔中再分別加入 15μL各級沉淀水溶液（1mg/m L），各樣品做3個平行孔；放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后取出細胞培養(yǎng)板，在每孔中加入10 μLWst染液，后再放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h；在酶標儀490 nm下檢測OD值，并計算3個平行孔的平均OD值，OD值低的孔中細菌生長受到抑制，由此篩選出有抗菌活性的沉淀。（5）高效液相分離：色譜柱為unitary C18，5 um，4.6mm×250mm；流動相為乙腈；洗脫梯度為0～12m in、乙腈10%～95%；12～26m in、95%乙腈；26～30m in、乙腈95%～100%。

進樣量為30μL；流速為1m L/m in；檢測波長為254 nm。每2m in接一管液體，共接15管，每管2m L，依此反復(fù)9次。

1.2.2 抗菌活性物質(zhì)的成分鑒定 按下列方法鑒定和鑒別。

（1）糖類鑒別采用Molish試驗，參考李孝棟和賈林的方法[14-15]。

（2）蛋白質(zhì)鑒定采用茚三酮試驗，參考許文彥等的方法[16]。

（3）酮、醛的鑒別，參考了趙蓮的方法[17]。

（4）脂類的鑒定，參考了王秀麗等的方法[18]。

（5）生物堿類成分的鑒別：①取上備酸水浸液四份（每份1m L左右即可），分別滴加碘-碘化鉀﹑苦味酸試劑﹑磷鉬酸試劑﹑硅鎢酸試劑。若四者均有或大多有沉淀反應(yīng)，表明該樣品可能含有生物堿，再進行下項試驗。②取上備其余酸水浸液，加Na2CO3溶液呈堿性，置分液漏斗中，加入乙醚約10m L振搖，靜置后分出醚層，再用乙醚3m L，如前萃取，合并醚液。將乙醚液置分液漏斗中，加酸水液10m L振搖，靜置分層，分出酸水液，再以酸水液5m L如前提取，合并酸水液，如此酸提液4份，分別作以下沉淀反應(yīng)：a．碘化汞鉀試劑（Mayer試劑）：酸水提液滴加碘化汞鉀試劑，產(chǎn)生白色沉淀。b．硅鎢酸試劑：酸水提取液滴加硅鎢酸試劑產(chǎn)生淡黃色或灰白色沉淀。此酸水提液與以上3種試劑產(chǎn)生沉淀反應(yīng)，即本樣品含有生物堿。

（6）能譜檢測：用高效液相分離前的粗提大腸桿菌抗菌活性物質(zhì)進行能譜分析。

（7）質(zhì)譜檢測：用高效液相分離后的大腸桿菌抗菌活性物質(zhì)進行質(zhì)譜分析。

1.2.3 抗菌活性物質(zhì)體外抗菌活性檢測 （1）抗菌活性物質(zhì)最低抑菌濃度(M IC)的測定：分別取病原菌大腸桿菌、巴氏桿菌、金色葡萄球菌、鏈球菌及菌青枯病菌單菌落進行液體培養(yǎng)，并將細菌培養(yǎng)液稀釋至106個/m l濃度。然后生理鹽水制成依此稀釋10倍的1～10號管混合液；從各管中分別取稀釋的菌液0.1m L均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)24 h后，對菌落進行計數(shù)。取5支滅菌試管，分別加入1m L液體培養(yǎng)基，然后移取1m L經(jīng)MTT篩選出的具有抗菌活性的組分液體（20μg/m L）加入1號試管，混勻，從1號試管中移取1m L液體至2號管中，混勻，依次稀釋到5號管，從5號管中取出1m L液體棄去。并分別于1，2，3，4號管中加入100μL的菌液（106個/m l濃度）。另取一試管，加入1m L LB液體培養(yǎng)基，100μL菌液作為對照。將稀釋好的溶液置于35℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察各試管的細菌生長數(shù)量，確定最低抑菌濃度。（2）最低殺菌濃度(MBC)的測定：取上述藥物最低抑菌濃度以上未見細菌生長的各孔培養(yǎng)物，分別吸取100μL，移種至不含藥的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，輕輕推開藥液，置37℃培養(yǎng)過夜，觀察有無菌生長，計數(shù)少于5個菌落者即為該藥的最低殺菌濃度。

1.2.4 抗菌活性物質(zhì)對擬南芥組織培養(yǎng)的影響 在無菌操作臺上將滅菌后的擬南芥野生型種子接入1/2 MS培養(yǎng)基中，25℃光照培養(yǎng)4周后成苗。配置1/2 MS培養(yǎng)基，設(shè)置三組，A組為空白對照，B組加入低濃度2%的抗菌活性物質(zhì)，C組加入高濃度5%的抗菌活性物質(zhì)，每組設(shè)置8個重復(fù)。將健壯的擬南芥植株接入上述3組培養(yǎng)基，觀察其生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌活性物質(zhì)的離心分離與MTT檢測結(jié)果

大腸桿菌堿裂解液分別經(jīng)10個不同梯度的離心后，得到10種不同分子量的沉淀物，將這些不同組分的沉淀物分別用MTT法進行抗菌活性測定，結(jié)果顯示：在6 000 r/m in梯度離心下所得沉淀物無抗菌活性，在7 000 r/m in梯度離心下所得沉淀物，其檢測孔中的細菌濃度低，透光性好，490 nm下的OD值最低，說明該組分的物質(zhì)能顯著抑制實驗細菌的生長，是一種抗菌活性物質(zhì)。檢測結(jié)果見圖1。

圖1 堿裂解法不同離心力粗提物MTT結(jié)果

大腸桿菌堿裂解液經(jīng)7 000 r/m in離心所獲得得沉淀物（粗提取物）于50℃下烘干后，得到棕黃色的粉末顆粒物（見圖2）。

圖2 大腸桿菌抗菌活性物質(zhì)粗品

2.2 抗菌活性物質(zhì)高效液相分離與MTT檢測結(jié)果

對在7 000 r/m in梯度離心下所得沉淀的水溶液，進行高效液相分離，并對不同洗脫時段的洗脫液進行MTT抗菌活性檢測。結(jié)果顯示：在高效液相色譜分離出的洗脫液中，第15～16m in的吸光度平均值最小，活細菌數(shù)量最少，說明其抗菌活性最強（見圖3）。

圖3 高效液相分離的MTT的活性檢測結(jié)果

2.3 抗菌活性物質(zhì)成分鑒定結(jié)果

將在7 000 r/m in梯度離心下所得的抗菌活性沉淀物分別進行糖類、蛋白質(zhì)、酮類、脂類和生物堿鑒定。Molish實驗顯示沒有紫紅色環(huán)出現(xiàn)，證明該抗菌活性物質(zhì)不含糖類成分；茚三酮顯色反應(yīng)結(jié)果未呈現(xiàn)出藍紫色，說明該抗菌活性物質(zhì)中不含有蛋白質(zhì)成分；銀鏡實驗證明該抗菌活性物質(zhì)中不含有酮、醛類成分；生物堿鑒定結(jié)果顯示，在鑒別1的四種生物堿鑒定試劑反應(yīng)中，有3種反應(yīng)出現(xiàn)了沉淀物，在鑒別2的4種生物堿鑒定試劑反應(yīng)中，有兩種反應(yīng)出現(xiàn)了沉淀物，結(jié)果表明該抗菌活性物質(zhì)中含生物堿（圖4）。

圖4 抗菌活性物質(zhì)鑒定結(jié)果注：左起一管是糖類鑒定結(jié)果，二管是蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果，三至六是生物堿鑒定結(jié)果，七是酮類鑒定結(jié)果。

2.4 抗菌活性物質(zhì)抑菌實驗結(jié)果

對在高效液相色譜第15～16m in洗脫分離出的抗性活性物質(zhì)進行一系列抑菌實驗，與對照相比較，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌、鏈球菌、巴氏桿菌、青枯病菌均有明顯的抑制作用。該抗菌活性物質(zhì)對金色葡萄球菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、青枯病菌的最小抑菌濃度（M IC）分別為2.5μg/m L、5μg/m L、0.625μg/m L、0.625μg/m L、1.25μg/m L，最低殺菌濃度（MBC）分別為5μg/m L、5μg/m L、1.25μg/m L、2.5μg/m L、2.5μg/m L （圖5-圖8）。

圖5 大腸桿菌在未加抗性物質(zhì)（左）和加抗性物質(zhì)（右）培育基中的生長狀況

圖6 巴氏桿菌在未加抗性物質(zhì)（左）和加抗性物質(zhì)（右）培育基中的生長狀況

圖7 鏈球菌在未加抗性物質(zhì)（左）和加抗性物質(zhì)（右）培育基中的生長狀況

圖8 青枯病菌在未加抗性物質(zhì)（左）和加抗性物質(zhì)（右）培育基中的生長狀況

2.5 抗菌活性物質(zhì)對植物生長的影響

在擬南芥的培養(yǎng)基中加入不同濃度的該抗菌活性物質(zhì)并設(shè)計空白對照，在接種后的一周和兩周后分別觀察擬南芥的生長情況，可以看出該抗菌活性物質(zhì)對擬南芥對的生長沒有影響，見圖9。

圖9 抗菌活性物質(zhì)對植物生長的影響A圖：左CK，中添加2%抗性物質(zhì)，右添加5%抗性物質(zhì)（接種7 d）；B圖：左CK，中添加2%抗性物質(zhì)，右添加5%抗性物質(zhì)（接種14 d）

3 討論

提取天然的抗菌活性物質(zhì)來防治細菌病已經(jīng)成為動植物抗菌制劑開發(fā)的新趨勢。從大腸桿菌中提取出抗菌活性物質(zhì)是找尋抗菌藥物的一種新思路。試驗用MTT法分別檢測了大腸桿菌的培養(yǎng)液、全菌、大腸桿菌超聲波裂解物和大腸桿菌鹽裂解物，均未檢測到抗菌活性，證明只能通過堿裂解才能釋放出具有抗菌活性的大腸桿菌的結(jié)構(gòu)成分，該成分應(yīng)該是大腸桿菌中共有的結(jié)構(gòu)成分，因試驗從標準菌株和分離菌株中均提取到該成分，活性并無差異。該活性物質(zhì)的抗菌活性高，達到常規(guī)抗生素的抑殺菌效度?？咕V廣，對動物源性多種革蘭氏陰性菌和陽性菌具有顯著抗菌效果，尤其對豬源巴氏桿菌抑菌效果更高。對植物源病原菌青枯病菌的抑菌效果也較高。并且該物質(zhì)耐高溫，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對動植物毒副作用小，因此具有作為一種新抗菌藥物的開發(fā)應(yīng)用的潛質(zhì)。

該抗菌活性物質(zhì)經(jīng)初步鑒定為一種生物堿，這也與只能經(jīng)堿裂解法提取該活性物質(zhì)的結(jié)果相吻合。但到底是何種物質(zhì)，本研究通過能譜檢測結(jié)果顯示，該活性物質(zhì)中含量高的元素依次為C、O、Na和N，質(zhì)譜鑒定仍為小分子混合物。目前，筆者正在做進一步分離純化和結(jié)構(gòu)分析。另外，其抑菌的作用機制還有待進一步研究。

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（責任編輯：吳 婷）

Prelim inary Test on a New Type of Antibacterial Substance

YILing-xiao1，CHEN Zhi-yong2，DONGWei3
（1.International College,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PRC;2.Biological Science and Technology College,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PRC;3.Veterinary Medicine College,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PRC）

Application of high-speed centrifugation and high-performance liquid chromatography to separation and purification obtained a new type of natural antibacterial substance from Escherichia coli cell.Against Staphylococcus aureus,Escherichia coli,Pasteurella multocida,Streptococcus,Pseudomonas,solanacearum them inimal inhibitory concentration(MIC)was2.5μg/m l,5μg/m l,0.625μg/m l, 0.625 g/m l and 1.25 g/m l,theminimum bactericidal concentration(MBC)was 5 g/m l,5 g/m l,1.25 g/m l,2.5 g/m l,2.5 g/m l,respectively composition identification of chemicalmethod andmassspectrometry shows that the antibacterialactive substance alkaloids;and the safety evaluation on themodelplantArabidopsisshows that theantibacterialactive substance had no inhibitory and adverse effects on the grow th and developmentof plants.The experimental results show that the antibacterialactive substance is a broad-spectrum,high efficiency,safe antibacterialnaturalproduct,with theprospectof developmentand utilization ofalternativeantibiotics.

antibacterial substance; alkaloid; Escherichia coli; blight;Arabidopsis thaliana

S182

A

1006-060X（2015）01-0099-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.01.032

2015-01-16

廣東省科技廳資助項目（2012B020401012）

易凌霄（1994-），男，湖南長沙市人，在讀本科，主要學(xué)科專業(yè)為生物科學(xué)。

董 偉