王尚顯,楊光穗,曾 淇,陳金花
(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所,海南省熱帶觀賞植物種質(zhì)創(chuàng)新利用工程技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,海南儋州571737;2.海南大學(xué)科技應(yīng)用技術(shù)學(xué)院,海南儋州571737;3.海南省農(nóng)業(yè)學(xué)校,海南???71100)
桃金娘組織培養(yǎng)初步研究
王尚顯1,2,楊光穗1,曾 淇3,陳金花1
(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所,海南省熱帶觀賞植物種質(zhì)創(chuàng)新利用工程技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,海南儋州571737;2.海南大學(xué)科技應(yīng)用技術(shù)學(xué)院,海南儋州571737;3.海南省農(nóng)業(yè)學(xué)校,海南海口571100)
以桃金娘莖段、葉片、種子為外植體,研究0.1%H g C l2和2%N aC l O單獨(dú)消毒和組合消毒的消毒效果,探索出適合不同外植體消毒的有效方法和時(shí)間;并對(duì)最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和無(wú)菌系建立途徑進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,組合消毒和消毒效率明顯優(yōu)于單一消毒劑消毒,其中單一消毒劑消毒時(shí)0.1%H g C l2的消毒效果又比2%N aC l O好;桃金娘莖段、嫩葉、老葉、果實(shí)的最佳消毒方式分別為:2%N aC l O浸泡10Mi n+0.1 %H g C l2浸泡8Mi n、2%N aC l O浸泡10Mi n+0.1%H g C l2浸泡6Mi n、0.1%H g C l2浸泡10Mi n+2%N aC l O浸泡8Mi n、0.1%H g C l2浸泡16Mi n。嫩葉較老葉和莖段更易誘導(dǎo)出愈傷組織,最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為2號(hào)培養(yǎng)基,愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)77.7%。無(wú)菌播種是桃金娘無(wú)菌系建立的最佳方式,萌發(fā)率高達(dá)75.0%。
桃金娘;組織培養(yǎng);消毒
桃金娘(Rhodomyrtus tomentosa)是桃金娘科桃金娘屬植物,因其花色美麗、花期長(zhǎng),果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富,根又可入藥,是一種優(yōu)良的園林觀花灌木和治療風(fēng)濕骨痛的藥材[1-2]。目前針對(duì)桃金娘的研究主要集中在藥用價(jià)值分析、加工利用、生態(tài)特性等方面,繁殖方法方面的研究少見(jiàn)報(bào)道,且僅限于播種繁殖和扦插繁殖。據(jù)現(xiàn)有報(bào)道,桃金娘扦插繁殖率極低,僅有5%左右,播種萌發(fā)率也僅有30%~40%[3-4]。目前桃金娘的利用主要依賴采集野生資源,而當(dāng)前的繁殖手段無(wú)法滿足人類對(duì)其的需求,因此開(kāi)展桃金娘快速繁育技術(shù)研究具有重要意義。
經(jīng)過(guò)近一個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展,組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為一種成熟的繁殖手段,并應(yīng)用在蝴蝶蘭、紅掌、龍血樹(shù)、竹芋等熱帶花卉的組織培養(yǎng)中。然而由于植物體的差異性,組培繁殖技術(shù)也存在一定的差異。特別在熱帶木本花卉的組培過(guò)程中常存在污染率和褐化率高,誘導(dǎo)率低的共性。為尋找一個(gè)桃金娘無(wú)菌體系建立的有效途徑,本研究以莖段、葉片、種子為外植體,研究不同消毒時(shí)間的消毒效果,并篩選出有效的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,以期建立桃金娘無(wú)菌系,并為桃金娘繁育體系增加新的途徑,為桃金娘快速繁殖提供新的參考和依據(jù)。
1.1 試驗(yàn)材料
為桃金娘莖段(頂芽下2~4節(jié))、葉(嫩葉和老葉)、種子(5分熟、8分熟和全熟),取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所種質(zhì)資源圃。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 消毒方法 采取新鮮桃金娘的莖段(頂芽下2~4節(jié))、葉片(嫩葉和老葉,下同)和種子(5分熟、8分熟和全熟,下同),用洗衣粉在自來(lái)水下清洗,轉(zhuǎn)至無(wú)菌工作臺(tái)用75%的酒精消毒2~3 s后,在用2%的次氯酸鈉(NaCl2O)、0.1%的生汞(HgCl2)中分別或依次進(jìn)行消毒。消毒方法見(jiàn)表1。
表1不同外置體的消毒方法 (Min)
1.2.2 培養(yǎng)基的配制 啟動(dòng)培養(yǎng)基為添加不同濃度2,4-D、NAA、6-BA的MS培養(yǎng)基,見(jiàn)表2,附加蔗糖20 g/L、卡拉膠8 g/L,Ph值5.8。培養(yǎng)室溫度控制在25±2℃,光強(qiáng)3 000 lux,每天光照12 h。
表2培養(yǎng)基激素配方(mg/L)
1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
污染率=污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。
褐化死亡率=褐化死亡外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。
誘導(dǎo)存活率=誘導(dǎo)存活外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。
2.1 不同消毒方法對(duì)莖段的消毒效果
不同消毒劑對(duì)莖段的消毒效率不同。在相同的消毒時(shí)間下,0.1%HgCl2的消毒效率明顯高于2%NaClO,但HgCl2對(duì)外植體的毒害作用也比較大,隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng),褐化死亡率明顯增加??梢?jiàn),如果單獨(dú)使用0.1%HgCl2的消毒時(shí)間不宜超過(guò)20Min。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,組合消毒的消毒效率明顯優(yōu)于單一消毒劑消毒,其中最佳的消毒組合為2%NaClO浸泡10Min后再用0.1%HgCl2浸泡8Min,誘導(dǎo)存活率可達(dá)到44.4%(見(jiàn)圖1)。由于莖段表面有許多絨毛,加之莖段上腋芽部分不易消毒,所以莖段的平均污染率都比較高。
2.2 不同消毒方法對(duì)葉片的消毒效果
圖1 不同消毒方法對(duì)莖段消毒效率的影響(處理1:2%N aC l2O浸泡20Mi n;處理2:2%N aC l2O浸泡25Mi n;處理3:2% N aC l2O浸泡30Mi n;處理4:0.1%H g C l2浸泡20Mi n;處理5:0.1%H g C l2浸泡25Mi n;處理6:0.1%H g C l2浸泡30Mi n;處理7:2%N aC l2O浸泡10Mi n后再用0.1%H g C l2浸泡6Mi n;處理8:2%N aC l2O浸泡10Mi n后再用0.1%H g C l2浸泡8Mi n;處理9:2%N aC l2O浸泡10Mi n后再用0.1%H g C l2浸泡10Mi n。)
從圖2可知,嫩葉和老葉的組合消毒方法也明顯優(yōu)于單一消毒的方法,隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng),褐化死亡率總體呈現(xiàn)逐步升高的趨勢(shì),這是由于消毒劑的毒害作用所致。由于嫩葉攜帶的微生物較老葉的少、單寧等物質(zhì)的含量較低,在相同的消毒方法和時(shí)間下,嫩葉的污染率和褐化率都比老葉的低,而誘導(dǎo)成活率都比老葉的高。嫩葉最佳消毒方法:2%NaClO浸泡10Min后再用0.1%HgCl2浸泡6Min;老葉最佳消毒方法為:2%NaClO浸泡10Min后再用0.1%HgCl2浸泡8Min。嫩葉比老葉更適合作為桃金娘組織培養(yǎng)的外植體材料。
2.3 不同浸泡方法對(duì)種子的浸泡效果
由于果實(shí)的果肉較厚,不同浸泡方法和時(shí)間對(duì)種子的浸泡效果無(wú)明顯差異,污染率均為0%,可選擇0.1%HgCl2浸泡16Min作為最佳的浸泡方法和時(shí)間。
2.4 不同培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果
2.2.1 莖段 1~3號(hào)培養(yǎng)基均不利于莖段從芽到芽的誘導(dǎo)。莖段培養(yǎng)18~20 d后即可觀察到白色致密的愈傷組織產(chǎn)生。其中2號(hào)培養(yǎng)基的愈傷組織的誘導(dǎo)時(shí)間最短,誘導(dǎo)率也最高,達(dá)41.3%;其次是3號(hào)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率為38.8%;1號(hào)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最低,為27.7%(見(jiàn)圖3)。
圖2 不同消毒方法對(duì)葉片消毒效率的影響(處理10:老葉用0.1%H g C l2浸泡16Mi n;處理11:老葉用0.1%H g C l2浸泡20 Mi n;處理12:老葉用0.1%H g C l2浸泡24Mi n;處理13:老葉用2%N aC l O浸泡10 Mi n后0.1%H g C l2浸泡6Mi n;處理14:老葉用2%N aC l O浸泡10Mi n后0.1% H g C l2浸泡8Mi n;處理15:老葉用2%N aC l O浸泡10Mi n后0.1%H g C l2浸泡10 Mi n;處理16:嫩葉用0.1%H g C l2浸泡16Mi n;處理17:嫩葉用0.1%H g C l2浸泡20Mi n;處理18:嫩葉用0.1%H g C l2浸泡24Mi n;處理19:嫩葉用2%N aC l O浸泡10Mi n后0.1%H g C l2浸泡6Mi n;處理20:嫩葉用2%N aC l O浸泡10Mi n后0.1% H g C l2浸泡8Mi n;處理21:嫩葉用2%N aC l O浸泡10Mi n后0.1%H g C l2浸泡10Mi n)
圖3 莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織
2.2.2 葉片 葉片誘導(dǎo)愈傷組織的時(shí)間短于莖段,培養(yǎng)15 d后即可觀察到愈傷組織的產(chǎn)生。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,以幼嫩的葉片在2號(hào)培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率最高,達(dá)77.7%(圖4);其次是幼嫩葉片在1號(hào)培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)效果,為66.6%;誘導(dǎo)率最低的是老葉在1號(hào)培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率,僅為11.1%。嫩葉在3種培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率均高于老葉;嫩葉和老葉在2號(hào)培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率均高于其他。
2.2.3 種子 種子播種后30 d開(kāi)始萌發(fā),沒(méi)有明顯的萌發(fā)高峰。不同培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果區(qū)別較大,成熟種子在1號(hào)培養(yǎng)基中的萌發(fā)率最高,為75%;其次是播種2號(hào)培養(yǎng)基中的5分熟的種子,而8分熟的種子總體萌發(fā)率都不高。種子萌發(fā)后發(fā)現(xiàn)在3號(hào)培養(yǎng)基中的植株生長(zhǎng)較其他培養(yǎng)基中健壯(見(jiàn)表3、圖5)。
圖4 嫩葉誘導(dǎo)出的愈傷組織
表3 不同培養(yǎng)基條件下不同外植體的誘導(dǎo)率和萌發(fā)率 (%)
圖5 不同培養(yǎng)基條件下種子的萌發(fā)情況
3.1 預(yù)處理和浸泡方法是無(wú)菌系建立的關(guān)鍵
植物組織培養(yǎng)過(guò)程中,無(wú)菌體系的建立是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵,而采自大田的實(shí)驗(yàn)材料極易粘附細(xì)菌和真菌等,建立無(wú)菌體系時(shí)不易浸泡,因此,必須根據(jù)材料幼嫩程度、材料類型等來(lái)決定浸泡方式和浸泡時(shí)間[5]。桃金娘屬熱帶植物,內(nèi)生菌十分豐富,加之常年高溫多雨,空氣濕度大,在莖葉表面滋生大量的微生物,并附著大量的霉菌袍子和細(xì)菌芽飽,甚至一些菌絲體浸入表皮內(nèi)的薄壁組織形成大量的內(nèi)生菌,給外植體浸泡造成很大的困難[6]。桃金娘葉片和莖段的表面有許多絨毛,為外植體的浸泡增加了困難。
針對(duì)浸泡困難的外植體,單獨(dú)使用一種浸泡劑浸泡其污染率比較高,達(dá)不到理想的浸泡效果,而多種浸泡劑的配合使用已經(jīng)在多種植物外植體的浸泡實(shí)驗(yàn)中獲得成功。如:姚娜和賴志強(qiáng)[7]研究象草腋芽的外植體浸泡中發(fā)現(xiàn)其最佳浸泡措施為:自來(lái)水沖洗60Min+0.1%HgCl2浸泡25Min+2%NaClO浸泡20Min,該措施的污染率極低而且成活率最高。韓佳宇等[8]對(duì)石栗樹(shù)腋芽外植體浸泡研究表明最佳浸泡組合為:自來(lái)水沖洗120Min+0.1%HgCl2浸泡16Min+2%NaClO浸泡24Min,其組合的污染率最低達(dá)到了16.67%,而且愈傷組織誘導(dǎo)成功率最高達(dá)到了80.00%。陶興魁等[9]在研究藍(lán)莓外植體浸泡方法時(shí)發(fā)現(xiàn)用70%酒精30 s+2%NaClO浸泡10Min+0.1%HgCl2浸泡10Min的組合效果最好,其污染率最低,成活率最高。在本實(shí)驗(yàn)中,采用了組合浸泡的方法在一定程度上提高了浸泡效率,降低污染率,莖段組合浸泡的存活率將單一0.1%HgCl2浸泡的9.2%提高到44.0%,即2%NaClO浸泡10Min后再用0.1%HgCl2浸泡8Min的組合浸泡方式。葉片組合浸泡即2%NaClO浸泡10Min后再用0.1%HgCl2浸泡 6 Min的存活率將單一 0.1% HgCl2浸泡最高的45.4%提高到77.7%。
除了通過(guò)組合浸泡的方式提高浸泡效率外,還可以通過(guò)選擇晴天采樣、采樣前移至室內(nèi)培養(yǎng)或噴灑農(nóng)藥、預(yù)處理時(shí)用農(nóng)藥浸泡、培養(yǎng)基中添加抑菌劑等方式來(lái)提高浸泡效率。
3.2 無(wú)菌系建立的途徑
植株再生有器官發(fā)生型和體細(xì)胞胚胎發(fā)生型兩個(gè)途徑。不同植物種類誘導(dǎo)形成愈傷組織的敏感性和難易程度不同。外植體、培養(yǎng)基種類、激素配比、培養(yǎng)條件均會(huì)影響愈傷組織的誘導(dǎo)情況,常規(guī)來(lái)說(shuō),幼嫩的材料比成熟的材料更易進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及其形態(tài)建成;同種的不同基因型個(gè)體在愈傷組織的誘導(dǎo)及其再生能力上又有差別;分生細(xì)胞和薄壁細(xì)胞較易誘導(dǎo)出愈傷[10]。本實(shí)驗(yàn)中,葉片更比莖段容易誘導(dǎo)出愈傷組織。
如果采用無(wú)菌播種的方式,最佳的萌發(fā)率可達(dá)83%,極大地提高了種子萌發(fā)率,顯著高于直接田間播種30%~40%的萌發(fā)率[4]。未來(lái)可借鑒此種方法開(kāi)展種子敞開(kāi)式培養(yǎng),即可提高萌發(fā)率又可打破無(wú)菌培養(yǎng)條件的局限性。相比葉片誘導(dǎo)愈傷組織途徑,無(wú)菌播種更具有無(wú)須經(jīng)脫分化步驟,更易更快速地建立無(wú)菌系的優(yōu)點(diǎn)。
3.3 愈傷組織褐化的防止方法
當(dāng)外植體組織被切割和接種時(shí),受到損傷的細(xì)胞中酚類物質(zhì)會(huì)被酚氧化酶氧化成有毒的醌類物質(zhì),這些物質(zhì)擴(kuò)散到培養(yǎng)基中抑制了其他酶活性,以至毒害整個(gè)外植體組織,組織變褐甚至死亡。研究者發(fā)現(xiàn),影響組織褐化的因素有基因型、外植體的生理狀態(tài)、外植體種類和大小、培養(yǎng)基、防褐劑的使用和培養(yǎng)條件等[11-12]。一般來(lái)說(shuō)褐變會(huì)隨著材料的年齡和組織木質(zhì)化程度而增加;外植體越小,而切面與體積的比率越大,褐化程度越大;在有些植物中胚培養(yǎng)比葉片培養(yǎng)褐變少、莖尖比莖段褐變少等;培養(yǎng)基中高濃度糖、高含量氨態(tài)氮、低水平pH值等都會(huì)不同程度地增加褐化;強(qiáng)光照和高溫也會(huì)對(duì)褐化強(qiáng)度產(chǎn)生影響[11,13]。在黃金蒲桃的組織培養(yǎng)研究中,研究者發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基最適的pH值為6.0,冬季取材較夏季和春季取材好,WPM和Anderson培養(yǎng)基對(duì)芽誘導(dǎo)的影響差異不大,莖段的取材部位優(yōu)于頂芽[14]。研究者認(rèn)為夏季取材時(shí)光照充足、溫度高,植物體內(nèi)的酚類酶活性也較高,故污染率和褐化率都較高。根據(jù)前人的研究經(jīng)驗(yàn),在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可使用低鹽、低糖培養(yǎng)基,并加入PVP、Vc等防褐劑,來(lái)減少外植體的褐化程度。
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(責(zé)任編輯:張煥裕)
Primary Study on Tissue Culture of RhodoMytrus toMentosa
WANG Shang-xian1,2,YANGGuang-sui1,ZENGQi3,CHEN Jin-hua1
(1.Tropical Crops Genetic Resoures Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences&The Engineering Technology Research Center of Tropical Ornamental PlantGermplasMInnovation and Utilization,Hainan Province&Key Laboratory of Corp Gene Resources and GermplasMEnhancement in Southern China,Technical college of HaiNan University,Danzhou 571737,PRC;2.Institution of Technology,Hainan University,Danzhou 571737,PRC;3.Hainan Agriculture School,Haikou 571100,PRC)
Using stem,leaf,seed of Rhodomytrus tomentosa asexplants,the paperanalyzed the disinfection effectof 0.1%HgCl2and 2% NaClO alone and in combination,explored the effective explants disinfectionmethod and time for Rhodomytrus tomentosa explants,and screened the optimal approach for inducedmedium.The research results showed that:the combination disinfection effectwas better than alone disinfection,and that of 0.1%HgCl2better than 2%NaClO;the best disinfection method for stem,tender leaf,old leaf,fruit of Rhodomytrus tomentosa was 2%NaClO immersed 10 Min+0.1%HgCl2immersed 8 min,2%NaClO immersed 10 min+0.1%HgCl2immersed 6min,2%NaClO immersed 10min+0.1%HgCl2immersed 8Min,0.1%HgCl2immersed 16Min respectively.Tender leaf is more easily induced callus than old leaf and stem.The best inductionmediuMis no.2media.Young leaves of callus induction rate was 77.7%.Sowingunderaseptic condition is thebestway to clone Rhodomytrus tomentosa,and thegermination rate isashigh as75.0%.
Rhodomytrus tomentosa;tissue culture;disinfection
S723.132
A
1006-060X(2015)04-0074-04
10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.024
2015-03-19
海南省重大科技項(xiàng)目(ZDZ X2013012);海南省星火產(chǎn)業(yè)帶項(xiàng)目(H N X H201427);海南省重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(ZD X M201 20025)
王尚顯(1992-),男,海南臨高縣人,研究實(shí)習(xí)員,研究方向?yàn)橛^賞園藝。
陳金花