羅孟君，鄧鳳君，郭巧紅，陳宗高，陳 波

1益陽醫(yī)學高等?？茖W校，益陽 413000;2 益陽市第一中學，益陽 413000;3 湖南師范大學化學化工學院，長沙 410081

分子印跡技術(molecular imprinting technology，MIT)是指為獲得在空間結構和結合位點上與某一分子(模板分子)完全匹配的聚合物的實驗制備技術，常常被形容為制造識別“分子鑰匙”的人工“鎖”技術。分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)是一類通過分子印跡技術合成的對特定目標分子(模板分子)及其結構類似物具有特異性識別和選擇性吸附的聚合物。由于其能夠特異性識別印跡分子，因此近年來被廣泛應用于色譜分離［1］、膜分離［2］、固相萃?。?］、藥物控制釋放［4］、化學傳感［5］、環(huán)境檢測［6］等領域。

1-脫氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin，DNJ)又名1-去氧野艽霉素，是一種哌啶類多羥基生物堿，化學名稱(2R，3R，4R，5S)-2-羥甲基哌啶-3，4，5-三醇，通常為白色粉末，分子式為C6H13NO4，其結構式如圖1。

圖1 1-脫氧野尻霉素結構式Fig.1 Chemical structure of DNJ

DNJ 是目前糖尿病治療藥物中唯一國際公認的零傷害生物制劑，具有對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，是降血糖、治療糖尿病的有效成分［7，8］，此外還具有抗病毒［9，10］、抗腫瘤轉移［11］等藥理作用。近年來，國內外學者對DNJ 的來源、在生物體內的合成機制及化學合成方法進行了大量的研究探索，希望為找到一種穩(wěn)定、高效、經濟的獲取DNJ 的途徑提供理論基礎。

本研究以DNJ 為模板分子，MAA 為功能單體，EGDMA 為交聯(lián)劑，2，2'-偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，乙腈為致孔劑，采用沉淀聚合法合成了對DNJ分子有特異性吸附、識別性能的MIP 微球，用于DNJ的選擇性吸附和富集。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1-脫氧野尻霉素標準品(批號:024K4076，美國Sigma 公司);甲基丙烯酸(MAA，99%，美國Sigma公司);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，98%，科密歐);偶氮二異丁腈(AIBN，化學純，阿拉丁試劑有限公司);乙腈(色譜純，科密歐)

恒溫水浴鍋(HH-4，鞏義市予華儀器有限責任公司);Agilent 1100 系列高效液相色譜儀，含F(xiàn)LD熒光檢測器;掃描電子顯微鏡(SEM，Hitachi S-4300，日本日立公司);電子天平(AX-200，日本Shimadzu Philippines 公司)

1.2 分子印跡聚合物微球的制備

1.2.1 溶劑的考察

準確稱取0.25 mmol 的DNJ，分別溶于氯仿、乙腈、四氫呋喃、甲醇四種溶劑中，對其溶解能力進行觀察。

1.2.2 反應時間的考察

在固定其他反應條件不變的前提下，采用不同的反應時間合成了1-脫氧野尻MIP 微球。通過對產率進行考察，從而確定最佳的反應時間。

1.2.3 DNJ 分子印跡聚合物微球的制備

稱取DNJ 溶于一定量乙腈中，加入功能單體MAA，于室溫下震蕩30 min，置于冰箱中過夜，使DNJ 與MAA 充分作用，然后加入交聯(lián)劑EGDMA 和引發(fā)劑AIBN，充分混勻后，向混合液中通氮氣10 min 除氧后密封，將混合液置于恒溫水浴箱，60 ℃熱聚合聚合24 h。聚合產物取出冷卻至室溫，離心獲得聚合物沉淀，用V(甲醇)∶V (乙酸)=9∶1 溶液洗掉模板分子和未聚合的功能單體和交聯(lián)劑，直至洗脫液中檢測不到模板分子，再用甲醇洗去過量的乙酸，于烘箱中40 ℃真空干燥。所得聚合物為MIP;同時按同樣方法不加DNJ 制備空白聚合物(NIP)。

1.3 吸附性能測定

1.3.1 標準曲線的繪制

準確稱取100.0 mg DNJ 標準品，用乙腈定容至10 mL 容量瓶，得到10 mg/mL 的DNJ 標準溶液母液，然后根據(jù)母液配制1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 μg/mL 的梯度標準溶液，按照文獻［14］所述柱前衍生-高效液相色譜法，用高效液相色譜-熒光檢測器測定，測得DNJ 峰面積A，繪制DNJ 溶液濃度與色譜峰面積值的工作曲線，并進行線性回歸處理。

衍生化處理條件為:取10 μL DNJ 對照品溶液，依次加入10 μL 0.4 mol/L K3BO3緩沖液(pH 8.5)、20 μL 5 mmol/L FMOC-Cl 乙腈溶液，混勻后于20 ℃下反應20 min，加入10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸水溶液以中止反應，反應液再加入到950 μL 0.1%醋酸中，經0.45 μm 微孔濾膜濾過后進行色譜分析。

色譜條件為:色譜柱為Inertsil ODS-2 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈:0.1%醋酸水溶液(50∶50，V/V)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，熒光檢測器激發(fā)波長為254 nm，吸收波長322 nm，進樣量15 μL。

1.3.2 聚合物吸附性能的測定

將100.0 mg 1-脫氧野尻霉素MIP 微球放入40 mL 磨口錐形瓶中，分別加入不同濃度的DNJ 乙腈溶液，室溫振蕩吸附24 h，離心分離后，取上層清液，用柱前衍生-高效液相色譜法測定DNJ 濃度，平行三次取平均值，根據(jù)吸附前后濃度變化計算聚合物的吸附量Q(mg/g);繪制出吸附量Q 與不同濃度關系的靜態(tài)等溫吸附曲線。同時考察NIP 微球的吸附性能。

其中:Co:吸附前溶液中DNJ 的濃度(mg/mL);Ce:吸附后溶液中DNJ 的濃度(mg/mL);m:稱取的分子印跡聚合物的質量(mg);V:DNJ 溶液的體積(mL)。

1.3.3 吸附動力學測定

根據(jù)聚合物吸附性能測定結果，分別稱取100 mg MIP 和NIP 微球至50 mL 磨口錐形瓶中，分別加入25 mL 濃度為0.5 mg/mLDNJ 乙腈溶液，然后將其放入恒溫振蕩器中室溫振蕩。每隔20 min 取20 μL 溶液進行色譜分析，測定溶液中DNJ 濃度，從而分析其吸附動力學性質。

1.4 MIP 微球的選擇性考察

為了考察MIP 微球的選擇性識別性能，選用1-脫氧野尻霉素的結構類似物N-甲基-1-脫氧野尻霉素作為競爭底物，在濃度為5.0 mmol/L 的乙腈溶液中進行平衡吸附實驗，測定達到平衡時溶液中的目標分子濃度，并計算出分離系數(shù)(KD)及1-脫氧野尻霉素與N-甲基-1-脫氧野尻霉素的分離因子(α)，其中，KD=cp/cs，cp(mmol/g)表示聚合物結合底物的濃度，cs(mmol/L)表示溶液中底物的平衡濃度，α為2 種不同底物的分離系數(shù)之比。

1.5 聚合物微球掃描電鏡分析

利用Hitachi S-4300 SEM 對聚合物微球的表面結構和粒徑進行分析。

2 結果與討論

2.1 DNJ 分子印跡聚合物的制備

2.1.1 溶劑的選擇

統(tǒng)一溶劑量為20 mL，溶解模板分子，實驗結果如表1 所示，只有乙腈和甲醇能夠溶解模板分子，結合印跡分子與功能單體之間的疏水作用，應選擇致孔效果較好的溶劑作為致孔劑，綜合考慮使用乙腈作為溶劑更合適。

表1 1-脫氧野尻霉素溶解性實驗Table 1 DNJ solubility experiment

2.1.2 聚合時間的考察

在固定其他反應條件不變的前提下，通過考察聚合產物產率隨時間的變化關系，對產率作圖得到圖2，由圖可知，聚合物產率隨時間增長而增大，當時間為24 h 時，得率為85.4%，此后時間增大，產率隨之增大的幅度已經很小，因此，本實驗以24 h 的聚合時間為最佳。

圖2 時間對聚合物產率的影響Fig.2 The influence of reaction time on polymerization rate

2.2 MIP 與NIP 對DNJ 吸附性能的考察

2.2.1 標準曲線

以色譜峰面積A 對標準溶液濃度C 進行線性回歸，得回歸方程:A=317974C +9983，相關系數(shù)R=0.9982，結果表明在1～10 μg/mL 之間，線性關系良好。

2.2.2 吸附量的考察

分別考察了MIP 與NIP 對不同濃度DNJ 溶液的吸附性能，繪制出了相應的等溫吸附曲線，吸附詳情見圖3。由圖可知，在0.1～0.8 mg/mL 范圍內，吸附量與溶液濃度成正相關性，當濃度達到一定程度，吸附量不再升高，達到飽和。而印跡聚合物的吸附量明顯大于非印跡聚合物，這是由于印跡聚合物中有預定的孔穴，孔穴中有特定排列的功能基能夠與模板分子產生作用，而非印跡聚合物中則沒有這種孔穴。

圖3 MIP 與NIP 對DNJ 分子的等溫吸附曲線Fig.3 Adsorption isotherm of theophylline MIP and NMIP

2.2.3 MIP 與NIP 微球的吸附動力學

對MIP 與NIP 微球進行吸附動力學測定，結果如圖4。

圖4 MIP 與NIP 吸附動力學Fig.4 Kinetics of adsorption of MIP and NIP

由圖4 可知，隨著時間增長，MIP 對DNJ 的吸附量逐漸增大，當吸附時間達到100 min，吸附接近飽和。NIP 對DNJ 吸附量不大，隨時間增長，也呈增大的趨勢。

2.3 MIP 微球對底物的吸附選擇性考察

本實驗以與1-脫氧野尻霉素結構類似的N-甲基-1-脫氧野尻霉素作為競爭底物，在濃度為5.0 mmol/L 的乙腈溶液中進行平衡吸附實驗。實驗結果如表2 所示:

表2 MIP 微球的選擇性Table 2 Selectivity of MIP microspheres

由表2 可知，與NIP 微球相比，MIP 微球對DNJ具有較好的選擇性。

2.4 MIP 與NIP 掃描電鏡分析

用掃描電子顯微鏡(SEM)分別觀測兩種微球的形貌，掃描結果如圖5 所示:

圖5 MIP(左)與NIP(右)掃描電鏡圖Fig.5 The SEM photographs of MIP and NIP

由圖5 可以看出，實驗中制備的MIP 與NIP 形態(tài)均一，除NIP 粒徑較MIP 大外，彼此間無明顯差異，這可能是由于模板分子DNJ 的存在，使得聚合物生成過程中其分子內部結構形成固定形狀的孔穴，從而空間排列發(fā)生了改變。

3 結論

本文采用沉淀聚合法制備了1-脫氧野尻霉素分子印跡聚合物微球，并對其制備方法進行了初步優(yōu)化。吸附性能考察實驗說明，印記聚合物對DNJ分子能選擇性吸附，MIP 吸附性能較NIP 強。吸附選擇性實驗結果表明，相對于與DNJ 結構相似的N-甲基-1-脫氧野尻霉素，本實驗所制備的MIP 微球對DNJ 有較強的選擇結合特性。該方法簡單易行，聚合物微球顆粒在1 μm 左右，為開發(fā)天然產物中1-脫氧野尻霉素的分離提純新工藝提供了理論基礎。

1 Yang Y(楊雨)，Ouyang Z(歐陽臻)，Chang Y(常鈺)，et al.Study on hypoglycemic effects of components in mulberry leaves.Food Sci (食品科學)，2007，28:454-456.

2 Gao WH(高文惠)，Liu B(劉博)，Pang J(龐軍)，et al.Determination of bitertanol and diniconazole in food by virtual-template molecularly imprinted solid phase extraction-HPLC.Modern Food Sci Technol (現(xiàn)代食品科技)，2013，10:2504-2508.

3 Yuan AH(原愛紅)，Ma J(馬駿)，Jiang XF(蔣曉峰)，et al.Screening of glucosidase inhibitors from various fractions of mulberry leaves.J Tongji Univ，Med Sci(同濟大學學報，醫(yī)學版)，2005，26(4):8-11.

4 Peng ZT(彭忠田)，Shen C(申璀)，Tan DM(譚德明)，et al.Anti-HBV activity of deoxynojirimycin derivatives in vitro.China Pharm (中國藥房)，2007，18:22-24.

5 Dong JW(董建偉)，Yang JT(楊軍亭)，Hou QE(侯清娥)，et al.Determination of malachite green in environmental water samples by spectrophotometry with molecularly imprinted solid phase extraction.J Food Safety Quality(食品安全質量檢測學報)，2013，04:1200-1206.

6 Dong SQ(董勝強)，Li CX(李承溪)，Zhu XF(朱秀芳)，et al.Study on the preparation and property of coumarin molecularly imprinted composite membranes.J Yunnan Univ(云南大學學報，自科版)，2014，01:101-107.

7 Allan G，Ouadid-Ahidouch H，Sanchez-Fernandez EM，et al.New castanospermine glycoside analogues inhibit breast cancer cell proliferation and induce apoptosis without affecting normal cells.PloS One，2013，8:76411.

8 Fuchs Y，Soppera O，Mayes AG，et al.Holographic molecularly imprinted polymers for label-free chemical sensing.Adv Mater，2013，25:566-570.

9 Lad VJ，Shende VR，Gupta AK.Effect of catanospermine，1-deoxynojirimycin or 1-deoxymannojirimycin on biological and functional activities of Japanese encephalitis virus in porcine stable kidney cells.Microbiol Res，2013，4:12.

10 Ryu KS，Lee HS，Kim KY，et al.Anti-diabetic effects of the silkworm (Bombyx mori)extracts in the db/db mice.Planta Med，2012，78:1246-1246.

11 Slowing II，Vivero-Escoto JL，Wu CW，et al.Mesoporous silica nanoparticles as controlled release drug delivery and gene transfection carriers.Adv Drug Delivery Reviews，2008，60:1278-1288.