侯珊珊趙遠紅賈英杰李 正李小江李全征尹紀(jì)紅張小瑞楊彩霞顧宏韜

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193；3.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津300120）

益肝降脂方預(yù)處理對酒精性脂肪肝SD大鼠肝臟PKCα表達的影響

侯珊珊1趙遠紅2賈英杰2李 正2李小江2李全征1尹紀(jì)紅1張小瑞1楊彩霞1顧宏韜3

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193；3.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津300120）

目的：觀察中藥益肝降脂方預(yù)處理對酒精性脂肪肝SD大鼠肝臟蛋白激酶Cα（PKCα）基因與蛋白表達的影響，探討益肝降脂方對酒精性脂肪肝內(nèi)源性保護機制的誘發(fā)與強化的效應(yīng)。方法：將116只SD大鼠隨機分為模型組與中藥干預(yù)組，所有大鼠均連續(xù)12周予高脂+酒精灌胃進行酒精性脂肪肝造模，中藥組分別于實驗第3周、第6周、第9周起實施干預(yù)。于實驗6、9、12周末不同時段宰殺取樣，觀察大鼠的一般情況及肝臟組織病理學(xué)變化以評價造模，蛋白免疫印跡法（Western blot）觀測PKCα蛋白表達量，RT-PCR法檢測PKCαmRNA的表達活性。結(jié)果：HE染色顯示模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)改變，肝細胞索紊亂，肝細胞呈不同程度的脂肪變性、點狀壞死及炎性細胞浸潤；中藥各干預(yù)組大鼠肝組織脂肪變均較模型組明顯改善。中藥各時段干預(yù)組大鼠肝組織PKCα蛋白含量與模型組比較均明顯升高，PKCαmRNA的相對表達量明顯高于模型組，且PKCαmRNA相對表達量隨用藥時間的先后呈進行性降低。結(jié)論：中藥益肝降脂方早期干預(yù)能促進PKCα基因和蛋白的表達，有顯著的藥物預(yù)適應(yīng)作用；益肝降脂方的預(yù)適應(yīng)作用與用藥早晚成正相關(guān)；中藥益肝降脂方防治酒精性脂肪肝的機制可能與早期促發(fā)內(nèi)源性保護實現(xiàn)預(yù)適應(yīng)相關(guān)。

益肝降脂方 酒精性脂肪肝 蛋白激酶Cα 實驗研究

益肝降脂方是我們臨床應(yīng)用多年具有升清降濁解郁功效的經(jīng)驗方，能有效調(diào)節(jié)酒精性肝?。ˋLD）的血脂代謝，降酶保肝，改善中醫(yī)癥狀[1]。本課題前期實驗已證實益肝降脂方具有類抗氧化劑樣效應(yīng)，能起到防護酒精性脂肪肝 （alcoholic fatty liver，AFL）的作用[2]。蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）屬絲氨酸/蘇氨酸激酶家族中的一種，是細胞內(nèi)外不同刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前由于其在肝細胞缺血/低氧預(yù)適應(yīng)內(nèi)源性保護機制中的作用而受到人們的廣泛關(guān)注。藥物預(yù)適應(yīng)（pharmacologic preconditioning，PPC）是用藥物模擬缺血預(yù)適應(yīng)中的介質(zhì)，使其產(chǎn)生預(yù)處理效應(yīng)，是減輕缺血再灌注損傷，保護組織的一種有效方法[3]。中藥具有安全范圍大、不良反應(yīng)小、作用靶點多等優(yōu)點，目前關(guān)于中藥在肝臟預(yù)適應(yīng)保護作用中的報道很少，且中藥預(yù)處理的作用機制復(fù)雜，尚未闡明。本研究在前期實驗證實益肝降脂方保肝降脂抗氧化作用的基礎(chǔ)上，嘗試通過不同時間的干預(yù)造模，觀察PKCα基因和蛋白的表達，分析中藥復(fù)方預(yù)處理是否誘導(dǎo)或協(xié)助產(chǎn)生預(yù)適應(yīng)樣效應(yīng)，探討PKCα在大鼠酒精性脂肪肝中的表達以及益肝降脂方對酒精性脂肪肝的保護作用是否與誘導(dǎo)促進PKCα的表達有關(guān)，為益肝降脂方防治ALD建立理論基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 動物 SPF級成熟雄性SD大鼠116只，（180± 20）g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，合格證：0023015，許可證：SCXK-（軍）2007-004，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物房。

1.2 藥物 益肝降脂方藥（黃芪∶葛根∶丹參∶蘇葉∶黃連∶水紅花子=2∶3∶1∶1.3∶0.8∶2）由本院制劑室按比例規(guī)范制備成中藥浸膏（含生藥1.33g/mL）。

1.3 試劑 PKC鼠抗人單克隆抗體（sc-8393）購自Santa Cruz公司，山羊抗小鼠IgG（ZB2305）、山羊抗兔IgG（ZB2301）、β-actin鼠抗人單克隆抗體 （TA-09）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，組織蛋白抽提試劑盒 （BSP003）、高靈敏ECL發(fā)光試劑盒（PW044）購自生工生物工程（上海）股份有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒（PC0020）、麗春紅染色試劑（P0012）、PVDF膜（ISEQ00010）、Western blot封閉液Ⅱ （奶粉，pH7.5）（PC0020）、TBS（pH8.0，20×）（T1080）、SDS-PAGE上樣緩沖液 （還原，4×）（P1015）均購自北京索萊寶科技有限公司，Western Show預(yù)染蛋白Marker（sm0671）由Thermo提供。高脂飼料（1%膽固醇，10%豬油，0.3%膽酸鈉，8%蛋黃粉，80.7%基礎(chǔ)飼料）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所提供；體積分?jǐn)?shù)56%牛欄山二鍋頭白酒（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司）。

1.4 主要儀器 分光光度計 （上海722RS型），LAUDA-C3型循環(huán)恒溫水浴箱 （泰克儀器有限公司），光學(xué)顯微鏡 （日本OLYMPUS公司），Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System（BIO-RAD USA），BIO-RAD ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD USA），Powerpac Basic電泳儀 （BIORAD USA），溫控?fù)u床（New Brunswich USA），ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀。

2 實驗方法

2.1 動物分組 在完成前期綜合評價益肝降脂方對實驗大鼠酒精性脂肪肝的藥效學(xué)研究后，本實驗參照前期造模成功實驗結(jié)合本期研究目的未設(shè)立正常對照組[4]，將116只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為模型組22只，中藥干預(yù)組94只（其中第3周干預(yù)組35只，第6周干預(yù)組31只，第9周干預(yù)組28只），飼養(yǎng)溫度18～22℃，相對濕度40%～70%。

2.2 造模與給藥 連續(xù)12周予SD大鼠高脂+酒精梯度灌胃進行酒精性脂肪肝造模，酒精劑量為1.5mL/100g，按每周測得體重每日早晚灌胃2次（時間間隔8h以上），酒精體積分?jǐn)?shù)初起為40%（4.8g·kg-1·d-1）并持續(xù)至第4周末，后增加至45%（5.4g·kg-1·d-1）至第8周末，第9周開始增加至50%（6.0g·kg-1·d-1）持續(xù)到12周末實驗結(jié)束（適應(yīng)性飼養(yǎng)不計入實驗周）。酒精性脂肪肝造模的同時，中藥干預(yù)組按藥理實驗方法學(xué)計算[5]，分別于第3周、第6周及第9周開始，酒精灌胃0.5h后，分別灌服中藥浸膏2mL，2次/d。

2.3 取材 分別于實驗第6周、9周、12周末隨機抽取各組大鼠數(shù)只，前1d禁食12h，自由飲水，于第2天稱重后乙醚麻醉，目內(nèi)眥取血后，3000r/min離心10min，分離血清，4℃冷藏。取血后迅速解剖，取下肝臟，在肝右葉部分距邊緣5mm處取0.8cm× 0.8cm×0.8cm大小肝組織2塊，分別放入潔凈的EP管中密封，-80℃冷藏；取肝左葉組織大小約1.0cm× 0.3cm×0.3cm一塊，浸泡于4%多聚甲醛中固定，切片行HE染色后，在顯微鏡下觀察肝組織的脂肪變、炎癥活動以及纖維化情況。

2.4 觀察及指標(biāo)測定方法

2.4.1 動物表現(xiàn) 每周測體重1次，每日觀察并記錄各組大鼠的精神、皮毛光澤、進食、大小便及飲酒情況。

2.4.2 內(nèi)源性保護的媒介物質(zhì)PKCα測定

2.4.2.1 蛋白免疫印跡法（Western blot）測定肝組織PKCα蛋白的表達 提取肝組織中總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量，根據(jù)SDS-PAGE上樣量需要，取適量樣品加入4×loading buffer后，100℃煮沸變性5min。濃縮膠恒壓80V，約40min；分離膠恒壓120V，電泳至溴酚藍到凝膠底部。設(shè)置恒流300mA，冰浴轉(zhuǎn)膜2h。轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染色試劑對膜染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。將膜浸沒在Western blot封閉液Ⅱ（TBST溶解的5%脫脂奶粉，pH7.5）中室溫輕搖90min（封閉液須覆蓋整張膜，且膜在其中能夠搖動為宜）。用Western blot封閉液Ⅱ稀釋一抗，室溫孵育30min，放4℃過夜，TBST洗膜7次。用Western blot封閉液Ⅱ稀釋二抗，目的蛋白用羊抗鼠-HRP 1∶10000或羊抗兔-HRP 1∶10000（根據(jù)一抗進行選擇）室溫孵育60min，TBST洗膜7次；內(nèi)參用羊抗鼠 β-Actin 1∶1000，室溫孵育30min，放 4℃過夜，洗膜 7遍，再加羊抗鼠-HRP 1∶10000二抗，室溫孵育60min，洗膜7次。分別用ECL試劑盒顯色，暗室顯影。用KS400圖像分析系統(tǒng)進行灰度掃描，目的條帶的光密度值與相應(yīng)內(nèi)參照β-actin的光密度比值即為目的蛋白表達的相對表達值。

2.4.2.2 實時熒光定量PCR檢測肝臟PKCαmRNA的表達 使用Trizol法提取肝臟組織總RNA，電泳檢測提取RNA的完整性，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，收集cDNA-20℃保存，參照UItraSYBR二步法熒光定量PCR試劑盒進行熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參基因，相同模板相同基因設(shè)3復(fù)孔，3次平行實驗，得到各擴增反應(yīng)的CT值。引物序列由Primer Premier5.0軟件在線設(shè)計，管家基因（GAPDH）引物序列——F：CAAGTTCAACG鄄GCACAGTCAA，R：CGCCAGTAGACTCCACGACA，產(chǎn)物長度為140bp；PKCα引物為——F：CAGTGC鄄CAAGTTTGCTGTTTT，R：ATCAGTGTCAGGTCCCT鄄TATCC，產(chǎn)物長度為93bp。PCR反應(yīng)條件：95℃2min，95℃ 10s，60℃ 40s，40個循環(huán)。

2.4.3 肝臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察 肉眼觀察肝臟的大小、顏色、質(zhì)地等外觀情況，取小塊用4%多聚甲醛固定的肝組織，經(jīng)過酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)及肝臟細胞脂肪變性及炎癥浸潤程度，病理組織學(xué)診斷參考《酒精性肝病診療指南》[6]。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理，計量資料結(jié)果以（±s）表示，計量資料選用多樣本單因素方差分析，等級資料選用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

實驗結(jié)束時，116只大鼠共死亡16只，其中模型組9只，第3周干預(yù)組2只，第6周干預(yù)組3只，第9周干預(yù)組2只。死因經(jīng)術(shù)后病理解剖證實，主要為灌胃不當(dāng)或反復(fù)酒精灌胃后返流入食道吸入肺部誤入氣管所致。

3.1 各組大鼠一般情況 初期各組大鼠精神狀況正常，皮毛光澤，飲食正常；灌酒后約15min后均出現(xiàn)行動遲緩、不同程度嗜睡、喜臥的狀態(tài)；隨造模時間延長，模型組大鼠皮毛干枯蓬亂、無光澤，易激惹，食量減少，大便偏稀，中藥組大鼠皮毛蓬亂、欠光澤，易激惹，但程度明顯輕于模型組，大便偏軟色深呈黑色，灌酒后行動遲緩，但少見嗜睡或嗜睡時間較模型組大鼠縮短。

3.2 PKCα蛋白在各組中的表達情況 Western Blot結(jié)果顯示，與模型組相比，中藥干預(yù)組大鼠肝臟PKCα蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且第3周干預(yù)組與第6周干預(yù)組、第9周干預(yù)組比較明顯升高（P＜0.05），中藥干預(yù)組PKCα蛋白表達水平隨開始用藥時間的延遲呈進行性下降。見圖1。

3.3 各組大鼠PKCαmRNA的水平變化 中藥各干預(yù)組PKCαmRNA相對表達量均顯著高于模型組（均P＜0.05），且中藥各干預(yù)組之間比較也存在明顯差異（均P＜0.05）。PKCαmRNA相對表達量在中藥各干預(yù)組中隨開始用藥時間的延遲呈進行性下降。見圖2。

圖1 益肝降脂方對SD大鼠肝臟PKCα蛋白表達的影響

圖2 各組大鼠肝臟PKCαmRNA的表達

3.4 各組大鼠肝臟病理情況 肉眼觀察：模型組大鼠肝臟色澤較正常肝臟色暗淡，表面粗糙，表面及切面呈灰黃色或布有白色脂肪斑點，質(zhì)地較脆韌，被膜與周圍組織粘連，包膜緊張，邊緣鈍而厚；中藥干預(yù)組大鼠肝臟呈紅褐色，質(zhì)地稍軟，肝臟薄膜與周圍組織有輕度粘連，邊緣稍鈍。

HE染色后光鏡下觀察，實驗結(jié)束時 （12周末）各組病理形態(tài)表現(xiàn)——模型組：肝小葉結(jié)構(gòu)改變，肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴，細胞胞質(zhì)呈現(xiàn)空泡狀，可見F3-4級脂肪變，肝竇略狹窄，病變以中央靜脈周圍最明顯，匯管區(qū)有炎性細胞浸潤，散在點狀壞死，個別標(biāo)本肝血竇周圍可見纖維組織輕度增生。第3周干預(yù)組（用藥9周）：肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞邊界較清，中度水樣變性，大鼠肝組織多表現(xiàn)為F1-2級脂肪變，匯管區(qū)少量炎性細胞浸潤，肝小葉內(nèi)偶見點狀壞死，未見纖維化和肝硬化形成。第6周干預(yù)組（用藥6周）：肝小葉結(jié)構(gòu)較規(guī)則，可見肝細胞體積增大，肝血竇變窄，多見混合型的脂肪變性，可見少量嗜酸性變、點狀壞死，匯管區(qū)可見大量炎性細胞浸潤及纖維增生。第9周干預(yù)組（用藥3周）：肝小葉結(jié)構(gòu)不規(guī)則，肝細胞體積增大，胞質(zhì)淡染，染色質(zhì)呈顆粒狀，甚至呈氣球樣變，肝血竇變窄，可見廣泛的混合型脂肪變性，中央靜脈周圍散在點狀壞死，匯管區(qū)可見大量炎性細胞浸潤及纖維增生。見圖3。

圖3 各組大鼠肝臟病理組織學(xué)變化（HE，×100）

4 討論

蛋白激酶C（PKC）是細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要物質(zhì)，其PKCα為經(jīng)典型PKC，主要存在于胞質(zhì)中，以Ca2+依賴形式從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)位到細胞膜上而被激活[7]，并導(dǎo)致一系列信號通路的開放，是重要的第二信使。研究發(fā)現(xiàn)在預(yù)處理對人肝細胞的保護作用中，PKC通路激活和預(yù)處理導(dǎo)致細胞保護作用是密切相關(guān)的，PKC的激活參與了細胞保護[8]。本研究在建立酒精性脂肪肝大鼠模型的同時予以中藥益肝降脂方不同時間點干預(yù)，觀察比較PKCα基因和蛋白在各組大鼠肝臟中的表達，探討益肝降脂方是否具有預(yù)適應(yīng)樣效應(yīng)。

藥物預(yù)適應(yīng)是指通過藥物激發(fā)或模擬機體內(nèi)源性物質(zhì)，而呈現(xiàn)的保護作用。藥物預(yù)處理的研究是基于對缺血預(yù)處理（IPC）保護機制的理解，因其可以有效避免IPC的有創(chuàng)性損傷，簡單易行，且便于控制劑量，目前已引起普遍關(guān)注，且具有廣泛的臨床應(yīng)用價值。預(yù)適應(yīng)樣保護的信號傳導(dǎo)路徑分三個環(huán)節(jié)：觸發(fā)物質(zhì)—中介物質(zhì)—效應(yīng)物質(zhì)[9]。觸發(fā)物質(zhì)主要是指預(yù)處理性短暫缺血時機體釋放的內(nèi)源性活性物質(zhì)，在受體水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；中介物質(zhì)以受體后多種蛋白激酶為主；效應(yīng)物質(zhì)主要包括產(chǎn)生終末效應(yīng)的細胞保護蛋白和離子通道。PKC通路激活在預(yù)適應(yīng)保護信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用，是下游效應(yīng)物質(zhì)發(fā)揮延遲保護作用的前提。

本研究采用高脂飲食聯(lián)合酒精灌胃法成功誘導(dǎo)SD大鼠AFLD模型，并以中醫(yī)不同時間點的干預(yù)模擬藥物預(yù)處理方式，結(jié)果肝臟組織病理學(xué)顯示，益肝降脂方各干預(yù)組肝臟組織改變較模型組輕，兩者存在差異。通過蛋白免疫印跡可以看出，中藥干預(yù)組大鼠肝組織PKCα蛋白較模型組高表達，且用藥越早，蛋白表達相對越多，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。 各組大鼠肝臟中PKCαmRNA的表達結(jié)果顯示，中藥干預(yù)組PKCαmRNA的相對表達量明顯高于模型組，兩者存在顯著性差異 （P＜0.05）；中藥各干預(yù)組組間比較，第3周干預(yù)組PKCαmRNA表達水平高于第6周干預(yù)組（P＜0.05），第6周干預(yù)組PKCαmRNA表達水平高于第9周干預(yù)組（P＜0.05）?？梢奝KCα蛋白和mRNA的表達隨用藥時間的先后，其表達量逐漸降低，PKCα蛋白和基因的表達與中藥干預(yù)時間的早晚呈正相關(guān)，表現(xiàn)出明顯的時、效一致趨勢。推測針對酒精性脂肪肝早期予益肝降脂方干預(yù)，能促進內(nèi)源性保護媒介物之一PKCα蛋白和基因的表達，從而誘導(dǎo)出預(yù)適應(yīng)樣效應(yīng)，PKCα可能參與了益肝降脂方對酒精性脂肪肝的保護作用。

總之，PKCα是應(yīng)激性肝損傷時內(nèi)源性保護信號傳導(dǎo)路徑的關(guān)鍵物質(zhì)，益肝降脂方不同時間干預(yù)可影響酒精性脂肪肝SD大鼠肝組織中PKCαmRNA和蛋白的表達，中藥用藥越早PKCα蛋白及mRNA表達越強，其防治酒精性脂肪肝的機制可能與早期促發(fā)內(nèi)源性保護實現(xiàn)預(yù)適應(yīng)相關(guān)。

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R575.505

A

1672-397X（2015）01-0070-04

侯珊珊（1989-），女，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)內(nèi)科學(xué)腫瘤方向。

趙遠紅，yuanhongzh98@163.com

2014-06-04

編輯：吳 寧

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)重點項目（11JCZDJC19900）