吳明謙，賈麗軍，文艷巧，郭 伶?

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧省錦州市凌河區(qū)畜牧獸醫(yī)局，遼寧 錦州 121000）

錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌血清型鑒定

吳明謙1，賈麗軍2，文艷巧1，郭 伶1?

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧省錦州市凌河區(qū)畜牧獸醫(yī)局，遼寧 錦州 121000）

本研究先后從錦州市太和區(qū)、凌海、北鎮(zhèn)、黑山、義縣等地采集以多發(fā)性漿膜炎為主要特征的病豬病料13份，在被檢的13份病料中分離到6株疑似副豬嗜血桿菌菌株，同時(shí)對(duì)所分離的菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)檢查、分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、PCR鑒定及血清型鑒定，最終證實(shí)6株為副豬嗜血桿菌，血清型分別為：血清4型1株、血清5型2株、血清12型1株、血清13型2株。本研究初步確定了錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌流行菌株的血清型，為豬場(chǎng)制定副豬嗜血桿菌病的防控措施提供理論依據(jù)。

豬；副豬嗜血桿菌；血清型

隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，副豬嗜血桿菌?。℉aemophi lus parasuis，HPS）已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的一種重要細(xì)菌性疾病。在我國，副豬嗜血桿菌病在集約化豬場(chǎng)內(nèi)發(fā)病率有明顯增加趨勢(shì)，主要引起4～9周齡的仔豬發(fā)病，以多發(fā)性漿膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等為主要特征，又稱豬格拉氏病，發(fā)病率通常在10%～20%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)40%以上。本研究先后從太和區(qū)、凌海、北鎮(zhèn)、黑山、義縣等地采集以多發(fā)漿膜炎為主要特征病豬的病料13份，在被檢的13份病料中分離到6株疑似副豬嗜血桿菌菌株，對(duì)分離菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)檢查、分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和PCR檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用Kieletein-Rapp-Gabrielson（KRG）方法對(duì)6株分離菌株進(jìn)行血清分型。本研究初步確定了錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌流行菌株的流行情況，為錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌病的研究積累重要的流行病學(xué)資料，為更好地防控該病奠定理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 檢驗(yàn)材料 自2013年7月到2014年5月，從太和區(qū)、凌海、北鎮(zhèn)、黑山、義縣等地?zé)o菌操作采集疑似副豬嗜血桿菌病病死豬的血液、心包液、胸腹腔積水、淋巴結(jié)、肺臟等病料，共采集病料13份。

1.2 參考菌株 副豬嗜血桿菌參考菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；金黃色葡萄球菌菌株和副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)血清型陽性血清由遼寧醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.3 主要試劑 加有20μg/mL煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）（北京希凱創(chuàng)新科技有限公司）和5%滅活新生牛血清的胰酪蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)（上海寶曼生物科技有限公司）；葡萄糖、山梨醇、硫化氫、乳糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、尿素酶等細(xì)菌微量生化反應(yīng)管以及靛基質(zhì)、甲基紅、V-P試劑盒均購自杭州天和微生物試劑有限公司；PCR Master Mix緩沖液購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成[1]。

2 試驗(yàn)方法

2.1 分離培養(yǎng) 將疑似副豬嗜血桿菌病豬的血液、心包液、胸腹腔積水、淋巴結(jié)、肺臟等病料進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，將病料經(jīng)無菌操作劃線接種于含NAD的TSA培養(yǎng)基上，在37℃條件下，并且有5%的CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑取培養(yǎng)后的副豬嗜血桿菌疑似菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

2.2 生化試驗(yàn) 用接種環(huán)挑取疑似副豬嗜血桿菌的純培養(yǎng)單個(gè)菌落，接種于無菌的含NAD的葡萄糖山梨醇、硫化氫、乳糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖尿素酶等生化培養(yǎng)基中，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察生化試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果。

2.3 衛(wèi)星現(xiàn)象試驗(yàn)[2]用接種環(huán)挑取疑似副豬嗜血桿菌的純培養(yǎng)單個(gè)菌落，接種于無NAD的鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直劃線接種在該培養(yǎng)基上，在37℃條件下，培養(yǎng)24 h，觀察是否具有“衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象”，同時(shí)觀察檢測(cè)菌株是否有溶血特性。另取分離菌培養(yǎng)物劃線于無NAD的鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃條件下，培養(yǎng)24 h，作為對(duì)照。

2.4 PCR鑒定[3]挑取TSA培養(yǎng)基上的單菌落進(jìn)行PCR鑒定。試驗(yàn)所用的引物參照GenBank等（2001）發(fā)表的HPS-16SrRNA基因進(jìn)行引物的合成，上游引物為：Hp1 5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’，下游引物為：Hp2 5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT–3’，目的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為822 bp。PCR反應(yīng)體系見表1。

將上述液體試劑混勻后放置于PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件詳見表2。

表1 PCR反應(yīng)體系Table1 PCR reaction system

表2 PCR反應(yīng)條件Table2 PCR reaction conditions

2.5 血清型鑒定 用副豬嗜血桿菌1～15型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作對(duì)照。對(duì)6株分離菌株用KGR試驗(yàn)進(jìn)行副豬嗜血桿菌血清型鑒定[4]。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 形態(tài)特性 分離菌株在TSA培養(yǎng)基上呈現(xiàn)灰白色圓形半透明的菌落；在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，24 h僅生長(zhǎng)出直徑1～2 mm的灰白色圓形半透明菌落，無溶血特性；對(duì)所分離的菌株進(jìn)行革蘭氏染色后，菌體為革蘭氏陰性短小桿菌，個(gè)別呈兩極濃染的球桿狀，無芽孢。

3.2 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果表明，所分離的副豬嗜血桿菌菌株對(duì)葡萄糖、山梨醇、硫化氫、乳糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、尿素酶的生化試驗(yàn)結(jié)果一致，對(duì)麥芽糖、甘露醇和乳糖的生化反應(yīng)不穩(wěn)定。所分離的菌株生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果均符合副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的生化試驗(yàn)特征。

3.3 衛(wèi)星現(xiàn)象試驗(yàn)結(jié)果 在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，呈現(xiàn)出明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”。將分離菌培養(yǎng)物劃線于無 NAD的鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，無菌落生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明所分離菌株均為NAD生長(zhǎng)依賴菌，符合副豬嗜血桿菌培養(yǎng)特征。

3.4 PCR鑒定結(jié)果 根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，DNA片段大小在822 bp。對(duì)采自錦州地區(qū)發(fā)病豬場(chǎng)的病料樣本在TSA培養(yǎng)基上分離的單個(gè)菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，以DL2000 DNA Marker為標(biāo)準(zhǔn)，可見待檢樣本1為陰性，待檢樣本2、3、4、5、6、7與預(yù)期大小相符合為陽性結(jié)果見圖1。

3.5 血清型鑒定結(jié)果 用副豬嗜血桿菌1～15型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作對(duì)照。對(duì)分離的6個(gè)副豬嗜血桿菌菌株進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示血清4型1株、血清5型2株、血清12型1株、血清13型2株。初步確定了錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌流行菌株的血清型，為豬場(chǎng)制定副豬嗜血桿菌病的防控措施提供理論依據(jù)。

4 討論

由于副豬嗜血桿菌生長(zhǎng)繁殖營(yíng)養(yǎng)要求較高，所以不易培養(yǎng)，分離比較困難，致使分離率較低。本研究的分離率僅為46.15%，所以臨床上經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中未分離到細(xì)菌并不代表副豬嗜血桿菌不存在用于副豬嗜血桿菌細(xì)菌分離的樣品最好選用未經(jīng)藥物治療的病豬。

本研究血清型試驗(yàn)鑒定結(jié)果表明，錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌流行菌株的血清型為4型、5型、12型13型，不能進(jìn)行血清分型的有7株，占被檢總數(shù)的46.15%。本試驗(yàn)結(jié)果符合國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道，Olvera A等[5]報(bào)道30%以上的加拿大分離菌株和美國分離菌株不能通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)分型。蔡旭旺等[6]曾報(bào)道副豬嗜血桿菌國內(nèi)的血清型為血清4型、5型、12型和13型?？梢姡鱾€(gè)國家和地區(qū)副豬嗜血桿菌流行的血清型具有一定的差異性。

本研究通過細(xì)菌的分離培養(yǎng)、血清型鑒定、分子生物學(xué)診斷，確定了錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌的血清型，對(duì)錦州地區(qū)副豬嗜血桿菌相應(yīng)診斷方法的建立和本病綜合防控措施的制定具有重要意義。

圖1 Hps 16SrRNA的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Hps 16SrRNA PCR Amp lified electrophoretic map

[1]郭伶，吳明謙，文艷巧.一例副豬嗜血桿菌病的診斷與防治[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014，06（12）：62-64.

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[6]蔡旭旺，劉正飛，陳煥春，等.副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)和血清型鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，24（1）55-58.

Identification of the serotype of Haemophilus parasuis in Jinzhou area

Wu Mingqian1,Jia Li jun2,Wen Yanqiao1,Guo Ling1*
(1.Animal Husbandry and Veterinary Col lege,Liaoning Medical University，Liaoning Jinzhou 121001；2.Linghe District of Jinzhou City Bureau of animal husbandry and veterinary medicine,Liaoning Jinzhou 121000)

This study col lected disease of swine disease 13 materials f rom Jinzhou Taihe Dist rict,Linghai,North Town,Yi County,which the main characteristics was mul tiple serositis.In examination of 13 disease materials we isolated 6 st rains of suspected Haemophi lus parasuis strains, and through the morphological examination,isolation and cul ture,biochemical test and PCR identi fication and serotype identi f ication,we final ly conf irmed that the six st rains of Haemophi lus parasuis,1 st rain of serotype 4,2 st rains of serotype 5,1 st rain of serotype 12,2 st rains of 13 sera type.This study initial ly identi fied the serotypes of Haemophi lus parasuis st rains in Jinzhou area,and provided a theoretical basis for swine formulation about Haemophilus parasuis disease’s prevention and cont rol.

Pig;Haemophilus parasuis;Serumtype

S852.61

1672-9692(2015)06-0033-04

2015-04-18

吳明謙(1990-)，男，本科在讀。

郭伶（1969-），女，碩士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)。

遼寧醫(yī)學(xué)院“校長(zhǎng)基金-奧鴻博澤基金”；遼寧省教育廳大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目。