原姣姣 ，王成章，2* ，葉建中，陳虹霞，張宇思，陶 冉，周 昊，2，劉玉紅

1中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室;國(guó)家林業(yè)局 林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210042;2 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091;3 隴南市翔宇油橄欖開發(fā)有限公司，隴南 746000

羥基酪醇(3，4-二羥基苯乙醇，Hydroxytyrosol，HT)，清除自由基的能力強(qiáng)，表現(xiàn)出獨(dú)特的生物活性［1-5］，如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心臟的冠脈血流等。還能抑制人類早幼細(xì)胞白血病細(xì)胞HL60［6］、腺癌細(xì)胞HT29 及HT29 克隆體19A［7］、女性乳腺癌MCF-7 細(xì)胞［8］等擴(kuò)散，透過阻滯腫瘤細(xì)胞的循環(huán)及誘發(fā)其凋亡，具有很好的抗癌活性。盡管羥基酪醇有諸多生物活性，但國(guó)際市場(chǎng)上還沒有批量生產(chǎn)天然羥基酪醇產(chǎn)品。天然羥基酪醇在橄欖葉中含量很低，僅有0.01%～0.8%［9］，大多數(shù)以酯化物(橄欖苦苷，Oleuropein，OE)的形式存在于油橄欖的各個(gè)部位。其中油橄欖果及葉中OE 含量高，尤其在葉中達(dá)到10%～17%［10］。目前HT 主要是從橄欖果、葉，以及在制備橄欖油或餐用橄欖果過程中產(chǎn)生的殘?jiān)蛷U水中分離的，而廢水中橄欖苦苷、女貞苷、毛蕊花苷等糖苷、黃酮苷及多酚類物質(zhì)成分復(fù)雜，分離效率低。現(xiàn)化學(xué)合成已有以酪醇［11］、3，4 -二羥基苯乙酸［12］、鄰苯二酚［13］、3，4-二羥基苯甲醛［14］等合成報(bào)道，但收率低，且原料和催化劑成本昂貴，反應(yīng)條件苛刻，無法工業(yè)化制備。采用生物轉(zhuǎn)化法合成羥基酪醇，大都以橄欖苦苷和酪醇進(jìn)行酶降解［15-17］或者菌種(細(xì)菌［18-20］和真菌［21，22］)的轉(zhuǎn)化。此法反應(yīng)條件溫和，轉(zhuǎn)化率高，環(huán)境污染小，具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

Briante 等［16］利用固定化的嗜高溫β-葡萄糖苷酶(pH=7.0，60 ℃)降解OE(橄欖葉提取物)，并從復(fù)雜的酶解物中分離出91%～94%以上的HT，但該方法成本昂貴。卜文文等［23］還對(duì)鹽酸法和β-葡萄糖苷酶法水解橄欖葉提取物制備羥基酪醇的方法進(jìn)行了結(jié)果比較，從生產(chǎn)成本角度認(rèn)為鹽酸法比酶法更適合，但酶法降解得到的羥基酪醇含量也很低，需要復(fù)雜的純化工藝來獲得高純度產(chǎn)品。

本實(shí)驗(yàn)采用高純度(81.04%)的橄欖苦苷橄欖葉提取物，篩選各種酶以確定最佳酶解效果和價(jià)格適宜的降解酶系，使其后續(xù)分離純化工作以及探討酶解機(jī)理相對(duì)簡(jiǎn)單。在單因素試驗(yàn)(時(shí)間、pH、溫度、酶底物比)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法(response surface methodology，RSM)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以測(cè)得的HT 含量為考核指標(biāo)，對(duì)pH、溫度、酶底物比的水平參數(shù)選擇進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而確定最佳酶解工藝，對(duì)油橄欖葉有效制備HT 具有重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

HT 對(duì)照品(純度≥98%)和OE 對(duì)照品(純度≥98%)，上海阿拉丁試劑公司。甲醇為市售色譜純?cè)噭?，磷酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等其余試劑均為市售分析純?cè)噭?。橄欖葉提取物(OE 含量為81.04%，HT 含量2%左右)，實(shí)驗(yàn)室自制，密封放于干燥器內(nèi)備用。中溫淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、木瓜酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡聚糖酶、半纖維素酶、單寧酶、β-葡萄糖苷酶均購于蘇柯漢(濰坊)生物有限公司。

日本島津LC-20AT-DAD 高效液相系統(tǒng)，島津UV-1800 紫外可見分光光度計(jì);ALE-200 梅特勒電子天平，ZWY-110X30 型水浴搖床，PHS-3C 型pH計(jì)，H1650 高速臺(tái)式離心機(jī)，HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，SHB-3 型循環(huán)水多用真空泵，KQ5200DE 數(shù)控超聲波清洗器，R-201D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.2 分析方法

液相條件為:色譜柱為C18ODS 色譜柱(250 ×5 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃，甲醇∶水=35∶45(0.2%磷酸)為流動(dòng)相，進(jìn)樣量10 μL，紫外吸收波長(zhǎng)為280 nm，流速為1 mL/min。

精確稱取HT 和OE 對(duì)照品5.7 mg 和4.5 mg一起置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解搖勻，并定容，密塞，得到濃度為0.57 mg/mL 和0.45 mg/mL的對(duì)照品混合標(biāo)準(zhǔn)母液。分別精密吸取此標(biāo)準(zhǔn)品溶液1、2、4、6、8、10、12、14、16 μL，自動(dòng)進(jìn)樣，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣3 次，分別取HT 和OE 的HPLC 峰面積平均值。然后，以HPLC 峰面積為縱坐標(biāo)，HT 和OE質(zhì)量(μg)分別為橫坐標(biāo)，繪制HPLC 標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出方程。采用液相分析法對(duì)酶解條件下(60 ℃，pH=5，酶解6 h)同一樣品測(cè)定6 次，并計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評(píng)價(jià)該方法的精密度。

1.3 酶解方法

選取中溫淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、木瓜酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡聚糖酶、半纖維素酶、單寧酶、β-葡萄糖苷酶這10 種酶。稱取相同酶活力的各種酶，在各種酶的最適pH(磷酸緩沖溶液，0.1 mol/L，50 mL)和最適溫度下，分別對(duì)500 mg 油橄欖葉提取物酶解6 h。酶解結(jié)束后，90 ℃滅酶10 min，酶解液在5000 rpm 離心10 min，過濾，然后進(jìn)行液相分析，得到OE 降解率和HT 含量。每次試驗(yàn)進(jìn)行3 次，求其平均值。OE 降解率=1-酶解液OE 含量/提取物OE 含量(81.04%);HT 含量=酶解液HT 含量/提取物質(zhì)量。

1.4 單因素試驗(yàn)

取500 mg 油橄欖葉提取物樣品置于100 mL 錐形瓶，加入50 mL 緩沖溶液(磷酸緩沖溶液，0.1 mol/L)和一定量的半纖維素酶，在一定溫度下酶解。酶解結(jié)束后，90 ℃滅酶10 min，酶解液在5000 rpm 離心10 min，過濾，用HPLC 分析濾液中HT 和OE，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各含量。

以O(shè)E 降解率和HT 含量為檢測(cè)指標(biāo)，以油橄欖葉提取物為原料，對(duì)pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)、時(shí)間(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)、酶底物比(1∶100、1∶50、1∶33.33、1∶25、1∶20、1∶10、1∶6.67、1∶5、1∶4、1∶3.33、1∶2.86、1∶2.5)進(jìn)行單因素探索試驗(yàn)，研究不同因素對(duì)半纖維素酶水解OE 效率的影響。每次試驗(yàn)進(jìn)行3 次，求其平均值。

1.5 響應(yīng)面法中心組合設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了考察各因素交互作用對(duì)油橄欖葉提取物酶解效率的影響及其影響因素的主次，并得到最佳酶解條件，采用中心組合設(shè)計(jì)，以pH、酶解溫度、酶底物比這3 個(gè)獨(dú)立變量為考察因素，利用Design-Expert 7.0 軟件進(jìn)行Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)，建立響應(yīng)值與影響因素間的數(shù)學(xué)模型。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面3 因素3 水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

以液相圖譜峰面積為縱坐標(biāo)，OE 和HT 質(zhì)量為橫坐標(biāo)，分別得到各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，OE在0.441～7.056 μg 內(nèi)與其峰面積呈線性關(guān)系。并且在此范圍內(nèi)線性回歸方程為y=1772846.78x +89802.31，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。HT 在0.5586～8.9376 μg 內(nèi)與其峰面積呈線性關(guān)系，并且在此范圍內(nèi)線性回歸方程為y=1199063.90x+119947.13，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。

液相分析OE 和HT 含量方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.92%和1.38%，說明其分析方法精密度較高，重復(fù)性好。

2.2 酶種類的確定

從文獻(xiàn)［15］可知，OE 降解為HT 需斷裂糖苷鍵和酯鍵。酯的水解反應(yīng)在酸性或者堿性條件下都可以進(jìn)行，不需要特定的酶來水解。本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)糖苷鍵的斷裂來選擇有針對(duì)性、專一性的降解酶系。據(jù)作用機(jī)制得知，中溫淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、半纖維素酶［24］這6 種酶都會(huì)對(duì)糖苷鍵有一定的斷裂作用。同時(shí)考察木瓜酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、單寧酶是否對(duì)糖苷鍵的斷裂有很好的作用。

在相同酶活力的各種酶降解下，由圖1 中可看出半纖維素酶的OE 降解率(91.04±1.25%)和HT含量(9.84±0.11%)都較高，其次為纖維素酶(65.94±1.35%，6.92±0.09%)和β-葡萄糖苷酶(56.37±1.95%，7.94±0.12%)。中性蛋白酶對(duì)OE 有著一定的降解效果(73.33±1.56%)，但HT含量(3.61±0.15%)卻不高。木瓜酶(37.38±1.97%，4.24±0.12%)、單寧酶(20.85±1.82%，3.36±0.16%)、糖化酶(17.95±1.46%，3.11±0.17%)、β-葡聚糖酶(13.31±1.75%，2.93±0.12%)和中溫淀粉酶(22.59±1.56%，3.92±0.12%)對(duì)油橄欖葉高含量OE 的降解效果都不理想，且堿性蛋白酶(8.03±1.73%，2.84±0.15%)的降解效率最差。故選半纖維素酶作為最佳酶種研究OE 的降解工藝。

圖1 酶的種類對(duì)油橄欖葉提取物酶解效率的影響(n=3)Fig.1 Hydrolysis efficiency of different enzymes on olive leaf extracts (n=3)

圖2 pH(A)、溫度(B)、時(shí)間(C)及酶底物比(D)對(duì)油橄欖葉提取物酶解效率的影響(n=3)Fig.2 Effects of pH (A)，temperature (B)，time (C)and ratio of enzyme quantity and substrate (D)on enzyme hydrolysis efficiency of olive leaf extracts (n=3)

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 pH 對(duì)油橄欖葉提取物酶解效率的影響

當(dāng)酶解溫度60 ℃，時(shí)間6 h，酶底物比為1∶10，不同pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)對(duì)酶解效率的結(jié)果見圖2(A)。OE 降解率和HT 含量都呈現(xiàn)出先增后減趨勢(shì)，在pH=5 時(shí)最高，OE 降解率和HT 含量分別為99.07±0.83%和10.32±0.12%。在pH 為4 和7 時(shí)結(jié)果都不佳，尤其是pH 為7，說明半纖維素酶的酶解反應(yīng)不適合偏堿性環(huán)境。所以選擇4.5、5、5.5 為考察實(shí)驗(yàn)的水平參數(shù)。

2.3.2 酶解溫度對(duì)油橄欖葉提取物酶解效率的影響

當(dāng)pH5，時(shí)間6 h，酶底物比為1∶10，不同酶解溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)對(duì)酶解效率的結(jié)果見圖2(B)。OE 降解率和HT 含量隨著溫度的增加呈現(xiàn)出增長(zhǎng)趨勢(shì)，在50 ℃時(shí)達(dá)到最大值之后，隨著溫度的升高兩者都急劇下降，酶解效率顯著下降，且80 ℃時(shí)酶活性很低。這可能由于半纖維素酶在80℃以上失去酶活力所致。所以選用40、50、60 ℃為考察實(shí)驗(yàn)的水平參數(shù)。

2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)油橄欖葉提取物酶解效率的影響

當(dāng)pH5，溫度60 ℃，酶底物比為1∶10，不同時(shí)間(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)對(duì)酶解效率的結(jié)果見圖2(C)。隨著時(shí)間增加，OE 含量顯著降低，HT 含量急劇增長(zhǎng)。但在6 h 之后，OE 降解率反而降低了，而HT 含量還持續(xù)增長(zhǎng)狀態(tài)?？赡苡捎谥癘E降解的中間產(chǎn)物還未能及時(shí)地生成HT，故隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其含量增加，但增長(zhǎng)趨勢(shì)不顯著。HT 含量在4、5、6、7 h 變化不大，考慮到影響大小的原因，此因子不考慮為考察實(shí)驗(yàn)的水平參數(shù)。

2.3.4 酶底物比對(duì)油橄欖葉提取物酶解效率的影響

當(dāng)pH5，溫度60 ℃，時(shí)間6 h，不同酶底物比(1∶100、1∶50、1∶33.33、1∶25、1∶20、1∶10、1∶6.67、1∶5、1∶4、1∶3.33、1∶2.86、1∶2.5)對(duì)酶解效率的結(jié)果見圖2(D)。OE 隨著酶量的增加其降解率增加，但酶底物比1∶10 之后的OE 降解率變化不大。HT 含量在酶底物比1∶10 時(shí)最高，在此之后隨著酶量的增加其含量降低。所以選1∶20、1∶10、1∶6.67 酶底物比作為實(shí)驗(yàn)的考察水平參數(shù)。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以HT 含量為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行Box-Behnken 3因素3 水平的設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示，方差分析 見表3、4。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding extraction yields

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of items in regression equation

從表3 可以看出，模型的F 值為14.98(P＜0.001)，表明方程達(dá)到極顯著，模型能夠用于真實(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè);而模型的失擬項(xiàng)F 值為20.12(P＜0.05)，表明方程失擬顯著，固對(duì)此模型進(jìn)行了手動(dòng)優(yōu)化，結(jié)果見表4。模型的F 值為113.34(P＜0.001)，表明方程達(dá)到極顯著，模型能夠用于真實(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè);模型的失擬項(xiàng)F 值為1.21(P＞0.05)，表明方程失擬不顯著，計(jì)算數(shù)值與實(shí)測(cè)數(shù)值能較好擬合。系數(shù)(R2=0.9960)和校正系數(shù)(=0.9872)也是模型很重要的參數(shù)，其結(jié)果顯示該模型有著很好的擬合關(guān)系。且信噪比(29.880)表明模型有著很好的信號(hào)。

在一次項(xiàng)中，X1pH 和X2溫度對(duì)油橄欖葉提取物酶解為HT 含量的影響達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，在二次項(xiàng)中pH、溫度和酶底物比對(duì)油橄欖葉提取物酶解為HT 含量的影響均達(dá)到極顯著水平(P＜0.001);在交互項(xiàng)中，X1X2和X2X3發(fā)現(xiàn)對(duì)Y 值有顯著性影響。綜上所述，各因素對(duì)油橄欖葉提取物酶解過程的影響復(fù)雜，受多方面的影響，并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

各項(xiàng)因素對(duì)酶解后HT 含量的影響經(jīng)回歸擬合后得到二次多項(xiàng)回歸模型為:

Y=11.16+0.20X1+0.39 X2+0.026X3+0.17X1X2+0.023X1X3+0.53X2X3–。式中，Y代表HT 含量(%);X1、X2and X3分別代表pH、溫度和酶底物比。根據(jù)回歸模型方程3 個(gè)因素前的擬合系數(shù)0.39＞0.20＞0.026 可知，3 個(gè)考察因素對(duì)酶解的影響大小為X2(溫度)＞X1(pH)＞X3(酶底物比)，pH 和溫度是酶解過程中主要因素。

表4 手動(dòng)優(yōu)化的回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of items in regression equation by manual optimization

2.4.2 響應(yīng)曲面圖分析

由圖3 可見，3 個(gè)交互項(xiàng)中X1X2、X2X3存在較為顯著的交互作用，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面的等高線圖呈橢圓狀，這說明:pH 與溫度這兩個(gè)因素存在相互影響，當(dāng)pH 值小時(shí)，即酸性相對(duì)強(qiáng)時(shí)，可將OE 降為HT，此時(shí)不需要很高溫度，反之，當(dāng)pH 值大時(shí)，即酸性相對(duì)弱時(shí)，較高溫度可以更好地降解OE;酶解溫度與酶底物比亦存在較為明顯的相互作用，這說明當(dāng)提取溫度較低時(shí)，加大酶的用量(酶底物比小)可有效提高HT 含量，而當(dāng)酶解溫度較高時(shí)，酶的活性也增加，同時(shí)為了防止酶活性過高繼而破壞酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，必須適當(dāng)減少酶的質(zhì)量(酶底物比大)。交互項(xiàng)X1X3的等高線形狀偏向于圓形，表明pH 與酶底物比這兩項(xiàng)的交互作用并不顯著，說明這兩者相互作用對(duì)酶解產(chǎn)物含量的影響較小。上述分析與模型回歸的方差分析基本一致。

圖3 各因素交互作用對(duì)HT 含量的影響Fig.3 Response surface plots and contour plots showing mutual effects of different factors on HT content

2.4.3 優(yōu)化與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過上述回歸模型分析并計(jì)算得到半纖維素酶水解油橄欖葉提取物的最佳工藝條件為:油橄欖葉提取物(81.04% OE)500 mg，pH 5.06，溫度54.80℃，酶底物比為1∶9.1，時(shí)間6 h?？紤]到實(shí)際實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的可操作性，將以上最優(yōu)參數(shù)分別調(diào)整為pH 5，溫度55 ℃，酶底物比為1∶9.1，并據(jù)此進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。平行測(cè)定3 次所獲HT 含量為(11.31±0.15)%，OE 的降解率為98.54±1.63%。與模型預(yù)測(cè)值(11.28%)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33%＜5%，說明經(jīng)該模型推測(cè)得到的最佳工藝參數(shù)對(duì)實(shí)際操作的預(yù)測(cè)較為可靠，有一定指導(dǎo)意義。

Briante 等［16］利用固定化的嗜高溫β-葡萄糖苷酶(pH=7.0，60 ℃)降解OE(橄欖葉提取物)，并從復(fù)雜的酶解物中分離出91%～94%以上的HT。此方法采用的橄欖葉提取物中OE 含量為37.7%，且可得到42.3 mg/100 mg 產(chǎn)物。說明嗜高溫β-葡萄糖苷酶對(duì)橄欖苦苷的降解效果很好，且固定化之后酶活更高。卜文文等［23］認(rèn)為橄欖葉中OE 水解為HT 的鹽酸法比酶解法效果好，且酸解后HT 含量為7.83%、酶解為3.91%。這可能由于此實(shí)驗(yàn)使用常溫且酶活低的β-葡萄糖苷酶水解的緣故。相比之下，其酶解結(jié)果沒有本實(shí)驗(yàn)結(jié)果高，但和本實(shí)驗(yàn)2.2中常溫β-葡萄糖苷酶和半纖維素酶的酶解效果結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)選用的酶種β-葡萄糖苷酶是常溫的(37 ℃)，效果有但不是最好;其次本實(shí)驗(yàn)使用的纖維素最適溫度為45 ℃，半纖維素的最適溫度為45～60 ℃，且纖維素和半纖維素中都還有β-葡萄糖苷酶系。所以由此可以看出，溫度對(duì)酶解OE 有著很大的決定作用，且本實(shí)驗(yàn)所選酶種中半纖維酶的酶解效果最好。

3 結(jié)論

半纖維素酶對(duì)油橄欖葉提取物的OE 有著很好的降解作用，且對(duì)影響其酶解效果的pH、溫度、時(shí)間、酶底物比4 個(gè)因素分別進(jìn)行了考察。在此基礎(chǔ)上對(duì)pH、溫度和酶底物比進(jìn)行3 因素3 水平的Box-Behnken 響應(yīng)面分析，建立了以HT 含量為響應(yīng)值的數(shù)學(xué)模型:Y=11.16+0.20X1+0.39 X2+0.026X3+0.17X1X2+0.023X1X3+0.53X2X3–，模型回歸方程顯著，可用于實(shí)際預(yù)測(cè)。

通過響應(yīng)面法優(yōu)化半纖維素酶水解油橄欖葉提取物的最佳工藝條件為:油橄欖葉提取物(81.04%OE)500 mg，pH 5，溫度55 ℃，酶底物比為1∶9.1，時(shí)間6 h。在此酶解工藝下，HT 含量為為11.31%，OE降解率為98.54%。

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