馬國(guó)財(cái)，趙麗娜，白紅進(jìn)

1塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2 塔里木大學(xué)分析測(cè)試中心，阿拉爾 843300

叉枝鴉蔥(Scorzonera divaricata)俗稱堿草，系菊科鴉蔥屬植物，多生于草原、半荒漠和荒漠地帶，能夠固定沙丘、戈壁和干河床上。全草入藥，能清熱解毒，主治療毒惡瘡［1］。目前，鴉蔥屬植物關(guān)于化學(xué)成分的研究文獻(xiàn)較多，主要有揮發(fā)油、無(wú)機(jī)物質(zhì)、氨基酸、萜類、甾體類、鞣質(zhì)、黃酮類化合物等［2-9］，文獻(xiàn)對(duì)叉枝鴉蔥的研究報(bào)道較少。陶大勇［2］等采用分光光度法測(cè)定了塔里木盆地叉枝鴉蔥中鞣質(zhì)的含量，陳瑛［3］等對(duì)叉枝鴉蔥有機(jī)溶劑提取物中生物堿進(jìn)行了測(cè)定，二者都沒(méi)有對(duì)其所含的鞣質(zhì)和生物堿單體化合物進(jìn)行進(jìn)一步的分離與檢測(cè)。

Harman［10］提出的自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為:自由基攻擊生命大分子造成的損傷是引起衰老的根本原因，也是誘發(fā)腫瘤等疾病的重要原因，這一學(xué)說(shuō)已經(jīng)廣泛的被人們所日益接受。近二十年來(lái)，對(duì)自由基及其清除率的研究已經(jīng)成為天然產(chǎn)物研究的熱點(diǎn)，各國(guó)研究人員越來(lái)越多的將注意力集中于篩選有阻斷自由基形成或抑制細(xì)胞過(guò)氧化活性的天然藥物研究，其中對(duì)黃酮類化合物的研究是自由基清除劑研究的熱門領(lǐng)域之一［11］。

本文利用紫外-可見分光光度法對(duì)叉枝鴉蔥全草中總黃酮清除DPPH 自由基活性進(jìn)行研究，為叉枝鴉蔥的合理開發(fā)利用和提高其生物利用度提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CARY-100 紫外可見光分光光度計(jì)(澳大利亞VARIAN 公司);KQ-400KDE 臺(tái)式通用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);JA1203 電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試劑

蘆丁對(duì)照品(德國(guó)Dr.Ehrdnstorfer 公司 批號(hào):60922);DPPH 自由基(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào):ALL1930);乙醇，硝酸鋁，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，三氯化鋁等，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 材料

叉枝芽蔥于2009年5 月，采集于新疆建設(shè)兵團(tuán)第四十五團(tuán)。自然陰干，粉碎，過(guò)60 目篩，待用。經(jīng)塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院劉艷萍副教授鑒定為菊科(Compositae)鴉蔥屬(Scorzonera)叉枝鴉蔥(Scorzonera divaricata)植物。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 叉枝鴉蔥總黃酮提取

精密稱取叉枝鴉蔥粉末1.000 g，加65%乙醇20 mL，微波提取20 min，功率40 W，濾過(guò)，殘?jiān)偌尤?5%乙醇20 mL，重復(fù)提取2 次，過(guò)濾，合并濾液，定容于100 mL 容量瓶中，備用。

2.2 蘆丁對(duì)照品溶液的制備

精密稱取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品13.60 mg 置50 mL 容量瓶中，加65%乙醇20 mL，超聲使溶解，再加65%乙醇定容至刻度，搖勻即得。蘆丁對(duì)照品濃度為0.272 mg/mL，備用。

2.3 顯色條件的考察［12］

2.3.1 顯色系統(tǒng)的篩選

方法1:分別精密吸取0.5 mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和2 mL 樣品溶液于10 mL 容量瓶中，加0.1 mol/L 的AlCl3溶液2 mL，搖勻，放置6 min;再加入1 mol/L 的4% NaoH 溶液3 mL，用65%乙醇溶液定容，搖勻，放置10 min，測(cè)定。

方法2:分別精密吸取0.5 mol 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和2 mL 的樣品溶液于10 mL 容量瓶中，加5%NaNO2溶液0.4 mL 搖勻，放置6 min;加10% Al(NO3)30.4 mL，搖勻，放置6min;再加4% NaOH 溶液4 mL，65%乙醇定容，搖勻，放置10 min，測(cè)定。

結(jié)果表明:方法2 顯色靈敏、穩(wěn)定，故采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 為顯色系統(tǒng)

2.3.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定

精密稱取蘆丁對(duì)照品溶液0.5 mL 和2.1 項(xiàng)下樣品溶液2 mL 分別置于10 mL 容量瓶中，加65%乙醇至3 mL，按2.3.1 項(xiàng)下方法2 進(jìn)行顯色，測(cè)定。以65%乙醇平行實(shí)驗(yàn)為空白參比，于400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［13］

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于容量瓶中，按2.3.1 項(xiàng)下方法2 操作，以第一份溶液為空白，在501 nm 處測(cè)定吸光度。吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程A=0.0124X-0.0322(r=0.9996)，表明蘆丁在27.2～163.2 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好。

2.5 叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

將2 mL 不同濃度叉枝鴉蔥總黃酮提取液與2 mL、40 μg/mL 的DPPH 自由基反應(yīng)，以相同濃度的蘆丁和VC 為對(duì)照，測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間的吸光度，研究不同濃度叉枝鴉蔥總黃酮與DPPH 自由基反應(yīng)隨時(shí)間推移的動(dòng)力學(xué)關(guān)系，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制不同濃度的叉枝鴉蔥總黃酮與DPPH 自由基隨時(shí)間推移的動(dòng)力學(xué)關(guān)系曲線圖。

2.6 叉枝鴉蔥總黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除率［14，15］

在叉枝鴉蔥總黃酮清除自由基的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究的基礎(chǔ)上，測(cè)定反應(yīng)平衡時(shí)的吸光度，按下式計(jì)算不同濃度叉枝鴉蔥總黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除率:K=［1-(Ai-Aj)/Ac］×100%。式中，K 為叉枝鴉蔥總黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除率，Ai 為加式樣反應(yīng)后DPPH 溶液的吸光度Aj 為不加DPPH，只加式樣的溶液的吸光度;Ac 為不加式樣，只加DPPH的溶液的吸光度。

圖1 蘆丁和樣品的吸收曲線Fig.1 Absorption curves of rutin and sample

圖2 DPPH 吸收光譜Fig.2 DPPH absorption spectrum

2.7 叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 自由基的IC50值的計(jì)算

IC50為半數(shù)抑制率濃度，即自由基清除率為50%時(shí)的自由基清除劑的濃度。運(yùn)用Graphpad Prism 5.0 計(jì)算IC50。

3 結(jié)果與分析

3.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

對(duì)照品和樣品溶液均在501 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故以501 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)(見圖1)。

3.2 叉枝鴉蔥總黃酮的提取

經(jīng)測(cè)定，叉枝鴉蔥總黃酮提取率為2.79 g/100g。

3.3 波長(zhǎng)-吸光度之間的關(guān)系

測(cè)定在乙醇-水介質(zhì)中的活性時(shí)，選擇測(cè)定波長(zhǎng)為517 nm(見圖2)。

3.4 叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 自由基的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果

不同濃度叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 自由基的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線圖(見圖3)。同時(shí)采用Graphpad Prism 5.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方程擬合，數(shù)學(xué)模型為:Y=(Y0-NS)* exp(-K* X)+NS，其中:Y0 表示最大吸光度;NS 表示當(dāng)時(shí)間達(dá)到一定量時(shí)，吸光度的最小極值;K 表示吸光度與時(shí)間對(duì)應(yīng)的斜率。擬合曲線方程各項(xiàng)數(shù)據(jù)(見表1)，并歸納5 組擬合曲線方程(見表2)。

圖3 各濃度擬合曲線圖Fig.3 Fitting kinetic curves of different concentrations

表1 動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果Table 1 Results of kinetics data

表2 動(dòng)力學(xué)曲線方程Table 2 Kinetic curve equation

從圖3 可以看出，不加樣品的DPPH 自由基隨時(shí)間的延長(zhǎng)其吸光度沒(méi)有變化，說(shuō)明DDPH 是一種穩(wěn)定的自由基，而加入不同濃度叉枝鴉蔥總黃酮的DPPH 自由基的吸光度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。在反應(yīng)前5 min 吸光度下降很快，5 min 后，吸光度下降緩慢，在30～45min 內(nèi)反應(yīng)達(dá)到基本平衡，該體系的吸光度不再下降。但當(dāng)叉枝鴉蔥總黃酮濃度越高時(shí)，反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間越短，對(duì)照蘆丁、VC亦表現(xiàn)出同樣的反應(yīng)規(guī)律。

圖4 叉枝鴉蔥總黃酮對(duì)DPPH 自由基清除率Fig.4 Scavenging rate of flavonoids from S.divaricata on DPPH free radical

3.5 對(duì)DPPH 自由基清除率

由圖4 可以看出，叉枝鴉蔥總黃酮對(duì)DPPH 自由基有明顯的清除作用，在5～25 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 自由基的能力為41.72%～87.72%。隨著濃度的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除能力增強(qiáng)，對(duì)DPPH 自由基的清除具量效關(guān)系。同蘆丁、VC相比，叉枝鴉蔥總黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除率明顯偏高于蘆丁和VC。

3.6 清除DPPH 自由基的IC50值

經(jīng)計(jì)算，叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 的IC50值為5.6 μg/mL，大于蘆丁IC506.2 μg/mL 和Vc 的IC507.3 μg/mL。說(shuō)明叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH自由基的效果好于二者。

4 討論

叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 自由基的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，根據(jù)公式:Y=(Y0-NS)* exp(-K* X)+NS，進(jìn)行求導(dǎo)，其中一階導(dǎo)數(shù)Y'=-(Y0-NS)* K*exp-kx＜0(恒小于零)說(shuō)明:吸光度隨著時(shí)間的增加而減少，而當(dāng)時(shí)間趨于無(wú)窮大時(shí)，吸光度無(wú)限趨近于NS 值。對(duì)其進(jìn)行二階求導(dǎo)，其導(dǎo)數(shù)為:Y″=(Y0-NS)* K2* exp-KX＞0(恒大于零)，說(shuō)明:吸光度隨時(shí)間的增加的變化率減小，而當(dāng)時(shí)間趨于無(wú)窮大時(shí)吸光度隨時(shí)間的變化率趨于不變，接近于零值。

根據(jù)5、10、15、20、25 μg/mL 擬合曲線圖分析可知，隨著樣品濃度的增加，NS 值逐漸減小，說(shuō)明樣品濃度對(duì)DPPH 的抗氧化性不斷增強(qiáng)。

從動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)可以看出，當(dāng)樣品濃度在5、10、15、20、25 μg/mL 時(shí)，所得五個(gè)具體曲線方程中Y0值與實(shí)際反應(yīng)值，隨著濃度的增加，差值從0.0025變成零，說(shuō)明該五組方程表達(dá)式均能很好的表達(dá)各個(gè)濃度樣品的實(shí)際反應(yīng)過(guò)程。一個(gè)模型五組方程不但本身線性相關(guān)性很強(qiáng)，回歸效果好，由于動(dòng)力學(xué)模型方程經(jīng)參數(shù)估值后所得的模擬計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值吻合較好，可以作為優(yōu)化工藝條件的控制依據(jù)。

叉枝鴉蔥總黃酮對(duì)DPPH 自由基有明顯的清除作用，清除DPPH 自由基的能力隨著濃度的增加而增加，并對(duì)DPPH 自由基的清除率具有量效關(guān)系。叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 自由基的IC50值為5.6 μg/mL，是一種有效的自由基清除劑。

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