楊建英，黃名錢，肖莉春，郭小權(quán)，孔祥峰

1中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室 湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，長沙 410125;2河南科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，洛陽 471003;3 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南昌 330045

由大腸桿菌(E.coli)感染引起的細(xì)菌性傳染病給畜牧業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟損失［1］。在畜牧生產(chǎn)中，由于抗菌藥物的濫用導(dǎo)致E.coli 的耐藥菌株不斷出現(xiàn)，耐藥譜不斷擴大，不僅增加了治療難度，也會產(chǎn)生嚴(yán)重的藥物殘留問題，并引起食品安全隱患［2］。我國中藥的資源豐富、種類眾多、作用各異，在防治疾病方面具有毒副作用小、無有害殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢，愈來愈被大家所關(guān)注［3，4］。筆者前期研究測定了29 味中藥的水提物和中性醇提物對10 個豬源耐藥大腸桿菌分離株和3 個大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的體外抑制活性，發(fā)現(xiàn)五倍子和連翹對13 株受試菌的抑制作用最強，山楂、秦皮、大黃、大青葉、黃連和黃芩對部分受試菌也有一定抑制作用［5］;同時測定了山楂、五味子、連翹和金銀花的水提物對豬源耐四環(huán)素大腸桿菌的體外抑制活性，發(fā)現(xiàn)四種中藥提取物均具有較強的抑菌活性，但與四環(huán)素混合使用其抑菌作用下降［6］。本試驗利用前期篩選出的4 種中藥提取物組成復(fù)方(下稱中藥復(fù)方)，進一步觀察其對大腸桿菌攻毒小鼠的保護作用，為其在大腸桿菌病防治中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物制備

試驗選用山楂(Fructus Crataegi，F(xiàn)C)、連翹(Fructus Forsythiae，F(xiàn)F)、金銀花(Flos Lonicerae，F(xiàn)L)和五味子(Fructus Schisandrae，F(xiàn)S)，均購自亳州長生中藥飲片有限公司。每種中藥各取100 g，分別加入500 mL 蒸餾水，武火加熱至沸騰，然后文火加熱，維持微沸1 h，期間不斷攪拌，4 層紗布過濾得濾液;在藥渣中再加入500 mL 蒸餾水，同法煎煮、過濾。合并濾液，加熱濃縮至100 mL，即每mL 煎液中含有1 g 生藥。4 種單味中藥的水提液等比例混合，制得中藥復(fù)方，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们凹訜嵬耆芙?，混勻?/p>

鹽酸四環(huán)素(Tetracycline，TC)，購自博美試劑公司。溶于蒸餾水后，配成1 mg/mL 溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 小鼠飼料制備

試驗用飼料為小鼠的商品飼料，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。飼糧的營養(yǎng)水平為:干物質(zhì)88.55%、粗灰分7.4%、粗蛋白20.3%、粗脂肪8.19%、能量22.51 MJ/kg(以干物質(zhì)為基礎(chǔ))。

稱取3 份等量飼料并粉碎，每份加入適量雙蒸水，使其成粘稠狀。在3 份飼料中分別按1%的比例加入1 mg/mL 的TC 溶液、1 g/mL 的中藥復(fù)方煎液、1 mg/mL 的TC 與1 g/mL 的中藥復(fù)方煎液等比例混合液。制成棒狀飼料后置于70 ℃烘48 h 后取出，作為試驗小鼠的飼料。

1.3 菌液制備

試驗攻毒使用的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株K88、K99 和K101，由中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所畜禽健康養(yǎng)殖研究中心保存。攻毒前，取復(fù)壯的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，分別接種到裝有50 mL LB 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃、200 rpm 條件下培養(yǎng)16～24 h，使菌液濃度為1 ×108CFU/L。用無菌LB 液體培養(yǎng)基將菌液稀釋1000 倍，3 種菌液等比例混合，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗動物、飼養(yǎng)管理及分組

試驗選用體重為18～20 g 的昆明小鼠50 只，雌、雄各半，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。購入后在清潔環(huán)境中單籠飼養(yǎng)2 d，以消除運輸應(yīng)激等因素的影響，期間飼喂無菌蒸餾水和商品飼料。觀察小鼠的健康狀態(tài)和行為。

將小鼠隨機分成5 組，每組10 只，雌、雄各半，分別為對照組、攻毒組、TC 組、中藥復(fù)方組、中藥復(fù)方+TC 組。對照組、攻毒組小鼠均飼喂商品飼料，其他各組飼喂制備好的相應(yīng)飼料。自由采食，自由飲用無菌水。連續(xù)飼喂2 周后，除對照組小鼠腹腔注射無菌生理鹽水外，其余各組小鼠均腹腔注射大腸桿菌菌液(0.1 mL/10 g)，攻毒后每3 h 觀察一次小鼠的精神狀態(tài)、腹瀉和死亡情況。

1.5 生長性能測定

試驗開始前對每只小鼠進行稱重，并記錄。試驗期間，記錄每只小鼠的日采食量;攻毒前，對各組小鼠進行稱重并記錄，計算平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.6 腸道損傷觀察

各試驗組取6 只剛死亡的小鼠，解剖并分離空腸和回腸組織，用生理鹽水清洗內(nèi)容物后，取2～3 cm 長的小腸組織置于10%中心福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后制作切片，H.E.染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察其病理學(xué)變化，并用測微尺測定腸絨毛高度并進行統(tǒng)計。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SAS 8.0 統(tǒng)計軟件按單因素設(shè)計對數(shù)據(jù)進行方差分析，不同處理組間平均值采用Duncan 法進行多重比較。P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥復(fù)方對大腸桿菌攻毒小鼠生長性能的影響

由表1 可見，試驗各組小鼠的初始重?zé)o顯著差異;連續(xù)給藥14 d 后，試驗各組小鼠的平均日增重、平均日采食量、料重比和末重差異均不顯著。

2.2 中藥復(fù)方對大腸桿菌攻毒小鼠死亡情況與存活率的影響

由表2 可見，攻毒后3 h，小鼠開始死亡，死亡小鼠數(shù)量依次為，中藥復(fù)方組3 只＜攻毒組4 只、中藥復(fù)方+四環(huán)素組4 只＜四環(huán)素組5 只;攻毒后6 h，死亡小鼠數(shù)量依次為，中藥復(fù)方組5 只＜中藥復(fù)方+四環(huán)素組7 只＜四環(huán)素組8 只＜攻毒組9 只;攻毒后12 h，死亡小鼠數(shù)量依次為，中藥復(fù)方組5 只＜中藥復(fù)方+四環(huán)素組8 只＜四環(huán)素組10 只、攻毒組10 只;攻毒后24 h，中藥復(fù)方組又死亡1 只，其他各組均停止死亡。整個試驗期間，對照組小鼠無發(fā)病或死亡發(fā)生。攻毒后48 h，中藥復(fù)方組的存活率最高，為40%;其次是中藥復(fù)方+四環(huán)素組，保護率為20%;但是攻毒組和四環(huán)素組小鼠均全部死亡。攻毒后，試驗各組小鼠均未見腹瀉癥狀。

表1 試驗各組小鼠的生長性能(n=10)Table 1 Growth performance of mice in each experiment group (n=10)

表2 試驗各組小鼠死亡情況及存活率Table 2 Mortality information and survival rate of mice in each experiment group

2.3 中藥復(fù)方對大腸桿菌攻毒小鼠小腸絨毛高度的影響

各試驗組小鼠的小腸形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化見圖1。大腸桿菌攻毒組小鼠的空腸和回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，出現(xiàn)出血、炎癥細(xì)胞浸潤等病變，用藥組上述病變得到不同程度的改善。由表3 可知，小鼠空腸絨毛高度，攻毒組、四環(huán)素組、中藥復(fù)方組和中藥復(fù)方+四環(huán)素組均顯著低于對照組(P＜0.05)，且4 個組之間差異不顯著;與攻毒組相比，四環(huán)素組、中藥復(fù)方組和中藥復(fù)方+四環(huán)素組有升高趨勢。小鼠回腸絨毛高度，對照組、四環(huán)素組、中藥復(fù)方組和中藥復(fù)方+四環(huán)素組均顯著高于攻毒組(P＜0.05)，且4個組之間差異不顯著;與對照組相比，四環(huán)素組、中藥復(fù)方組和中藥復(fù)方+四環(huán)素組均有降低趨勢。

圖1 各組小鼠的小腸形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)(H.E.)Fig.1 Morphological structure of small intestine in mice of each group (H.E.)

3 討論

大腸桿菌感染可引起動物發(fā)病，主要表現(xiàn)為腹瀉、精神沉郁、反應(yīng)遲鈍，嚴(yán)重者因脫水、代謝性酸中毒而死亡，有時在沒有出現(xiàn)腹瀉等臨床癥狀前就突然死亡。剖檢表現(xiàn)為腸道充氣、充血明顯，腸壁變薄、松弛，腸黏膜上皮脫落等［7］。本試驗以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株K88、K99 和K101 聯(lián)合攻毒后，死亡小鼠剖檢可見腸道腫脹、充血，十二指腸和空腸中充滿黃綠色積液，回腸中充滿乳白色黏稠液體，腸壁上有出血點或出血斑;病理切片可見出血、炎癥細(xì)胞浸潤等病變;嚴(yán)重者，小腸黏膜、黏膜下層和肌層均有充血、出血等病變，與自然發(fā)病動物的臨床癥狀和病理變化相同，說明用本方法能夠成功制備小鼠的大腸桿菌病模型。

本試驗以自擬的中藥復(fù)方預(yù)防小鼠的大腸桿菌病，產(chǎn)生了一定的保護作用，其中中藥復(fù)方組小鼠的存活率高達40%，中藥復(fù)方+四環(huán)素組小鼠的存活率為20%，顯著高于攻毒組和四環(huán)素組小鼠的存活率。中藥復(fù)方對大腸桿菌攻毒小鼠的保護作用與其組份藥具有較強的體外抑菌作用有關(guān)［6］。攻毒后試驗各組小鼠的死亡時間表現(xiàn)出一定的差異。攻毒后3 h，死亡小鼠數(shù)量依次為，中藥復(fù)方組3 只＜攻毒組4 只、中藥復(fù)方+四環(huán)素組4 只＜四環(huán)素組5只，在一定意義上也說明了中藥復(fù)方提高了機體的抵抗力。攻毒后3 h 四環(huán)素組小鼠死亡最多，可能與使用四環(huán)素后細(xì)菌內(nèi)毒素大量釋放引起機體毒血癥有關(guān)［8，9］。另外，該中藥復(fù)方對不同性別的大腸桿菌病患鼠的保護作用存在差異，是否提示性激素參與了其保護作用的調(diào)節(jié)過程尚需要進一步研究。

腸道是機體消化、吸收和代謝營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，也是重要的免疫器官［10］。腸絨毛是小腸的重要組成部分，其強有力、有規(guī)則地擺動有助于阻止有害菌的定植;同時，腸絨毛的長度與形態(tài)變化也直接影響其表面積，進而影響腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力［11］。本試驗病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌攻毒后，小鼠的空腸和回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，絨毛高度顯著降低;提前2 周飼喂添加四環(huán)素、中藥復(fù)方、中藥復(fù)方+四環(huán)素的飼料，可對大腸桿菌攻毒引起的空腸和回腸損傷表現(xiàn)出一定的抵抗作用，其中中藥復(fù)方的效果最為明顯。這說明中藥復(fù)方的預(yù)防給藥一定程度上可以保護小腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能，使其免受大腸桿菌的攻擊與感染，所以中藥復(fù)方組的大腸桿菌攻毒小鼠的成活率較高。

綜上所述，本試驗選擇四種對豬源耐藥大腸桿菌分離株具有較強抑制作用的中藥提取物組成中藥復(fù)方，可以一定程度地保護大腸桿菌攻毒小鼠的小腸結(jié)構(gòu)和功能，顯著降低病死率，對大腸桿菌病有較好的保護作用。

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