王宗成，蔣玉仁，劉小文，姜紅宇，何福林*

1湖南科技學(xué)院湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，永州 425100;2 中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長沙 410083

生姜(Zingiber officinale Roscoe)是姜屬植物姜的根莖，是一種極為重要的香辛味調(diào)料，同時(shí)還是一味重要的中藥材，我國衛(wèi)生部將其公布為首批藥食兼用植物資源之一，其具有散寒解表，溫中止吐，回陽通脈，燥濕消痰的功效，經(jīng)中醫(yī)傳統(tǒng)炮制方法可將生姜變成干姜、炮姜等不同作用的中藥材［1］。生姜的化學(xué)成分復(fù)雜，目前，研究已確認(rèn)含揮發(fā)油、姜辣素(姜酚)、黃酮類等化學(xué)成分達(dá)200 余種［2，3］。有關(guān)生姜生物活性物質(zhì)的功效研究越來越廣泛，具有抗氧化、抗衰老、降血脂、抗腫瘤、降血糖、抑菌、護(hù)膚美容等多方面的生物活性［4］。這些多樣性的活性為開發(fā)功能性的生姜藥品、保健品、調(diào)味品、化妝品和綠色農(nóng)藥等提供了巨大的潛力與空間［5，6］。生姜中含有豐富的黃酮類化合物，其黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，并強(qiáng)于檸檬酸和抗壞血酸［7］。從生姜塊莖中提取黃酮類化合物的報(bào)道較多［7-9］，生姜皮中黃酮類化合物的提取也有報(bào)道［6］，而有關(guān)生姜莖葉中活性物質(zhì)的提取及研究還未見報(bào)道，生姜莖葉少許鮮嫩部位作為家畜食物，大部分丟棄在地里，形成了極大的資源浪費(fèi)。因此，從廢棄的生姜莖葉中提取有效成分，充分開發(fā)生姜莖葉的用途，變廢為寶，提高生姜的附加值，優(yōu)化自然資源，無論從經(jīng)濟(jì)效益還是社會(huì)效益來看，都具有長遠(yuǎn)的意義。本實(shí)驗(yàn)對生姜莖葉中總黃酮提取工藝和抗氧化活性進(jìn)行研究，以期探明生姜莖葉中黃酮的含量、提取工藝的優(yōu)化條件和抗氧化活性強(qiáng)弱，為生姜莖葉開發(fā)抗氧化保健食品或天然抗氧化劑，提高生姜廢棄物加工的綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

1.1.1 原料與試劑

生姜莖葉，采自湖南永州，經(jīng)清洗，60 ℃真空烘箱中烘干粉碎后過60 目篩;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)(批號(hào):100080-200707);乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、L-(+)-抗壞血酸(Vc)、2，6-二叔丁基對甲酚(BHT)等均為分析純試劑。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

UV-1750 型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司;RE-52B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;TE124S 電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;離心機(jī)(LD4-2A)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠;中興FW-200 高速萬能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司;集熱式磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取在120 ℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品5.0 mg 至50 mL 容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得到對照溶液(含蘆丁0.1 mg/mL)。再精密吸取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0與6.0 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 分鐘后各加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再分別加入4% NaOH 溶液4.0 mL，再加水至刻度，搖勻，放置10 min，在510 nm 波長處測定吸光度，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度(C，mg/mL)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為:A=11.257 C +0.0193，R2=0.9992，在0.01～0.06 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取10.0 g 干燥粉碎的生姜莖葉粉，用一定濃度的乙醇，在設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件下(考察料液比、提取次數(shù)、乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間五個(gè)因素)回流提取，將提取液抽濾，將濾渣按第一次提取條件再提取一定次數(shù)，合并濾液濃縮至約30 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，搖勻作為樣品溶液。取樣品溶液1.0 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，再用70%乙醇定容至刻度，搖勻，取該溶液2.0 mL，置于10 mL 容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出測定稀釋后樣品溶液總黃酮濃度C。然后計(jì)算樣品中總黃酮的提取率，總黃酮提取率單位mg/g 以mg蘆丁當(dāng)量/g 生姜莖葉干粉質(zhì)量計(jì)算。

式中，C 為稀釋后樣品溶液總黃酮濃度(mg/mL);N 為稀釋倍數(shù):50;V 為最初樣品定容體積(50 mL);m 為樣品質(zhì)量(10.0 g)。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取出乙醇濃度(A)、提取溫度(B)和提取時(shí)間(C)3 個(gè)對生姜莖葉黃酮提取影響比較顯著的因素，在固定料液比1∶30、提取次數(shù)2 次的條件下，根據(jù)Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，采用經(jīng)典的三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)表，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)確定生姜莖葉中黃酮提取的最佳工藝［10，11］。Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

1.2.4 抗氧化活性測定

1.2.4.1 生姜莖葉黃酮總還原能力的測定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測定樣品溶液總黃酮濃度，然后再稀釋成不同黃酮濃度進(jìn)行抗氧化活性測定。參照Vaquero 等［12］的方法稍作修改，在10 mL試管中依次加入2.5 mL pH 為6.6 的磷酸緩沖溶液，1.0 mL 不同濃度提取液和1.0 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液，搖勻，50 ℃水浴加熱20 min，急速冷卻，再加入2.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液在3000 rpm 的轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液5 mL 與4 mL 的蒸餾水和1.0 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的三氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min，于可見光700 nm 處測定吸光值，蒸餾水調(diào)零，吸光度越大，說明還原能力越強(qiáng)。以Vc 和BHT 作為對照。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.4.2 生姜莖葉黃酮清除羥基自由基能力測定

參照Smironff 等［13］的方法并加以改進(jìn)。在10 mL 比色試管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2.0 mL、不同質(zhì)量濃度的待測液2.0 mL、6 mmol/L 的H2O2溶液2.0 mL，搖勻靜置10 min，再加入6 mmol/L 的水楊酸溶液2.0 mL，搖勻，靜置30 min后于510 nm 處測其吸光度;做3 次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。陽性對照用Vc 和BHT 同法操作。

式中，A0為空白對照;A1為某質(zhì)量濃度黃酮類組分的吸光度;A2為無水楊酸時(shí)的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取次數(shù)對提取率的影響

取樣品10.0 g，乙醇濃度70%，料液比1∶30，恒溫70 ℃，按每次120 min 回流提取，分別提取1、2、3、4 次提取測定生姜莖葉總黃酮含量，考察提取次數(shù)對生姜莖葉總黃酮提取率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取次數(shù)越多提取率越大，實(shí)際上，提取2 次時(shí)生姜莖葉總黃酮已基本溶出較完全，為了節(jié)省時(shí)間和節(jié)約溶劑，從工業(yè)成本和提取周期角度來看，選取提取2 次。

2.1.2 料液比的對提取率的影響

取樣品10.0 g，乙醇濃度70%，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 提取，恒溫70 ℃，回流提取兩次，每次120 min 的條件提取測定生姜莖葉總黃酮含量，考察料液比對生姜莖葉總黃酮提取率的影響。結(jié)果如圖1A 所示，在一定范圍內(nèi)隨著料液數(shù)值的增大黃酮的提取率呈增加趨勢，雖然料液比為1∶50 時(shí)，提取率最大，但料液比超過1∶30 后，提取率基本穩(wěn)定，考慮到生產(chǎn)成本，宜選取料液比1∶30。

圖1 料液比(A)、乙醇濃度(B)、提取溫度(C)及提取時(shí)間(D)對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio (A)，ethanol concentration (B)，extraction temperature (C)and extraction time (D)on the yield of total flavonoids

2.1.3 乙醇濃度對提取率的影響

取樣品10.0 g，分別以50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液為提取溶劑，料液比1∶30，恒溫70℃，回流提取兩次，每次120 min 的條件提取測定生姜莖葉總黃酮含量，考察乙醇濃度對生姜莖葉總黃酮提取率的影響。結(jié)果如圖1B 所示，提取率隨乙醇濃度遞增呈先增后減的變化趨勢，在乙醇濃度為70%左右時(shí)，提取生姜莖葉總黃酮的效果更佳?？赡苁怯捎陔S著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，黃酮類化合物達(dá)到飽和，同時(shí)一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親酯性強(qiáng)的成分溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競爭同乙醇-水分子結(jié)合，從而導(dǎo)致黃酮類化合物的提取率下降。

2.1.4 提取溫度對提取率的影響

取樣品10.0 g，乙醇濃度70%，料液比1∶30，回流提取兩次，每次120 min，分別于50、60、70、80、90℃的條件提取測定生姜莖葉總黃酮含量，考察提取溫度對生姜莖葉總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖1C所示，提取率先隨著提取溫度的提高而提高，在提取溫度為80 ℃時(shí)，生姜莖葉總黃酮的提取率達(dá)到最高。在初始階段，隨著提取溫度的升高黃酮類化合物提取率升高，但是溫度過高可能引起黃酮類化合物結(jié)構(gòu)被氧化導(dǎo)致其提取率降低。

2.1.5 提取時(shí)間對提取率的影響

取樣品10.0 g，乙醇濃度70%，料液比1∶30，恒溫80 ℃，回流提取兩次，分別每次回流提取30、60、90、120、150 min 的條件提取測定生姜莖葉總黃酮含量，考察提取時(shí)間對生姜莖葉總黃酮提取率的影響。圖1D 顯示提取時(shí)間在60～120 min 之間溫度對生姜莖葉總黃酮提取率的總體影響不是很大，提取時(shí)間達(dá)90 min 以后提取率不增反而減少了。這可能是提取時(shí)間太長，某些黃酮類化合物分解所致。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 Box-Benhnken 設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

從單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，乙醇濃度(A)、提取溫度(B)和提取時(shí)間(C)3 個(gè)因素對生姜莖葉黃酮提取影響比較顯著，因此在固定料液比1∶30、提取次數(shù)2 次的條件下，選取這三個(gè)因素作為影響因子，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

采用Design expert 8.0.6 軟件對表2 中實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，得到生姜莖葉黃酮提取率(Y)對乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸模型方程為:

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的方差分析

為了檢驗(yàn)回歸方程的有效性，進(jìn)一步確定各因素對總黃酮提取率的影響程度，對回歸模型進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

從表3 可知，模型的F=106.95、P＜0.0001，差異極顯著;失擬項(xiàng)的P 值為0.2728＞0.05，差異不顯著，說明方程對實(shí)驗(yàn)有較好的擬合性，實(shí)驗(yàn)誤差較小。相關(guān)系數(shù)R2=0.9928 和調(diào)整系數(shù)Adj.R2=0.9835 也表明模型擬合程度較好，響應(yīng)值的變化有98.35%來源于所選因素，即來源于乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間，說明模型擬合度好，回歸方程能很好的描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，該實(shí)驗(yàn)方法可靠［10，11］。變異系數(shù)(CV)為1.65%說明模型的重現(xiàn)性很好，該模型可用于優(yōu)化生姜莖葉總黃酮提取的工藝條件。

回歸模型中一次項(xiàng)B 和C，交互項(xiàng)AB，二次項(xiàng)A2、B2和C2的P 值均小于0.01，說明提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度和提取溫度的交互項(xiàng)以及3 個(gè)因素的二次項(xiàng)都具有顯著影響;而其他交互項(xiàng)、乙醇濃度及缺失項(xiàng)顯著性較差。表明實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，而是一種非線性關(guān)系［11］。

圖2 各提取因素之間的交互作用影響Fig.2 Response surface plots showing the mutual effects of different factors on the yield of polysaccharides

響應(yīng)曲面坡度越陡峭，表明響應(yīng)值對于操作條件的改變越敏感，反之曲面坡度越平緩，操作條件的改變對響應(yīng)值的影響也就越?。?1］。圖2 直觀地反映了各因素交互作用對響應(yīng)值的影響，乙醇濃度和提取溫度交互作用曲面陡峭，表明其對總黃酮提取率的交互作用明顯。各因素的效應(yīng)關(guān)系為:B(提取溫度)＞C(提取時(shí)間)＞A(乙醇濃度)。

2.2.3 最佳工藝條件

用Design-expert 8.0.6 軟件對二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得到最佳的提取條件為乙醇濃度70.21%、提取溫度76.50 ℃、提取時(shí)間94.77 min，預(yù)測提取率為15.39 mg/g。但考慮到實(shí)際操作的局限性，將乙醇回流提取生姜莖葉黃酮的提取工藝修正為∶乙醇濃度70%、提取溫度76 ℃、提取時(shí)間95 min。根據(jù)此條件并在料液比1∶30、提取次數(shù)2次條件下進(jìn)行了3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到黃酮的實(shí)際平均提取率為15.42±0.09 mg/g，與理論預(yù)測值15.39 mg/g 接近，表明此響應(yīng)面法得到的回歸模型具有一定的可靠性。

2.3 抗氧化活性測定

2.3.1 生姜莖葉黃酮總還原能力的測定

以VC和BHT 作為對照，測定了生姜莖葉黃酮的總還原能力，結(jié)果如圖3 所示，在測定濃度范圍內(nèi)，生姜莖葉黃酮、VC和BHT 的還原能力隨著濃度的增大逐漸增強(qiáng);生姜莖葉黃酮具有良好的還原能力，其總還原能力在測定范圍內(nèi)強(qiáng)于BHT，弱于VC。

圖3 生姜莖葉黃酮、BHT 和抗壞血酸的還原能力Fig.3 Reducing ability of flavonoid extract of Z.officinale stem and leaves，BHT and Vc

2.3.2 生姜莖葉黃酮清除羥基自由基能力測定

以VC和BHT 作為對照，測定了生姜莖葉黃酮清除羥基自由基能力，結(jié)果如圖4 所示，在測定范圍內(nèi)，生姜莖葉黃酮、VC和BHT 對羥基自由基的清除能力隨濃度的增大而增大，根據(jù)測定結(jié)果求出線性回歸方程，計(jì)算出IC50，生姜莖葉黃酮和VC清除羥基的IC50分別為0.50 mg/mL 和0.27 mg/L，BHT 清除羥基的IC50約為2.31 mg/mL。可見，生姜莖葉黃酮對羥基自由基具有較高清除作用，清除活性比VC弱，但強(qiáng)于BHT。

圖4 生姜莖葉黃酮、BHT 和抗壞血酸對羥基自由基的清除能力Fig.4 Scavenging effects of flavonoid extract of Z.officinale stem and leaves，BHT and Vc on hydroxyl radical

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化提取生姜莖葉中總黃酮的工藝，得到的最佳工藝條件為:乙醇濃度70%、提取溫度76 ℃、提取時(shí)間95 min，在此條件下理論提取率為15.39 mg/g，與實(shí)測值15.42±0.09 mg/g 基本相符，說明本實(shí)驗(yàn)的模型擬合程度高，準(zhǔn)確有效，可用于生姜莖葉黃酮提取工藝的優(yōu)化篩選。

體外抗氧化活性表明，生姜莖葉總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力，與相同濃度的Vc 和BHT 比較，生姜莖葉黃酮總還原能力和清除羥基自由基的能力比VC弱，但強(qiáng)于BHT，且隨著濃度的增大，其清除能力增強(qiáng)。由此可見，生姜莖葉總黃酮作為抗氧化保健食品或天然抗氧化劑具有廣闊的開發(fā)前景。

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