楊艷紅，李世川，蘭世玉，朱 巍

重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院生物工程系，重慶 400054

α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)以隨機(jī)作用方式切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內(nèi)的α-1，4 糖苷鍵，生成糊精、低聚糖和單糖，廣泛用于糧食加工、釀造、紡織品、制藥、飼料、石油開(kāi)采等行業(yè)［1］，在工業(yè)生產(chǎn)中占有極其重要的地位。目前，工業(yè)上，都是采用微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)α-淀粉酶，是用途較廣泛的一種酶制劑，占據(jù)了整個(gè)酶制劑市場(chǎng)份額的25%左右［2，3］。

目前，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)中常用的中溫和高溫α-淀粉酶的適用pH 范圍一般為6.0～8.0，在酸性條件下其酶活性明顯降低，已不能滿(mǎn)足一些酸性條件下淀粉原料的深加工工藝的要求［4，5］。如我國(guó)淀粉原料的深加工過(guò)程一般需要經(jīng)過(guò)液化和糖化，液化過(guò)程中使用的淀粉酶其最適的pH 在6.0 左右，但在隨后的糖化過(guò)程中，糖化酶的最適pH 在5.0 左右，這就會(huì)出現(xiàn)在淀粉液化后要耗費(fèi)大量酸堿來(lái)調(diào)pH，而耐酸性淀粉酶的開(kāi)發(fā)將有助于解決液化酶和糖化酶最適pH 存在差異的這個(gè)難題。耐酸性α-淀粉酶是一類(lèi)可以在較低pH 值條件下水解淀粉的酶類(lèi)，最適pH 一般為4.0～5.5［6］，可使淀粉原料深加工工藝中的液化和糖化在同一pH 條件進(jìn)行，進(jìn)而簡(jiǎn)化工藝，節(jié)約成本。另外，耐酸性α-淀粉酶還可以用于高麥芽糖漿的生產(chǎn)、開(kāi)發(fā)新型助消化劑以及工業(yè)廢液處理等多個(gè)領(lǐng)域，能有效減少加工工藝過(guò)程中化學(xué)試劑的消耗［7］，降低副產(chǎn)物的形成，減少環(huán)境污染，具有重大經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益［2］。

解淀粉芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，脂肪嗜熱芽孢桿菌在工業(yè)生產(chǎn)中被認(rèn)為是最好的α-淀粉酶生產(chǎn)菌株［8］。本文主要對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的一株產(chǎn)高活性酸性α-淀粉酶的野生菌株進(jìn)行鑒定和酶學(xué)性質(zhì)研究，以期為該酸性α-淀粉酶的工業(yè)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

AF1，本實(shí)驗(yàn)室分離。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

生長(zhǎng)培養(yǎng)基:馬鈴薯20.0 g，蔗糖3.0 g，蛋白胨2.5 g，尿素0.33 g，NaCl 1.0 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯20.0 g，蔗糖2.0 g，蛋白胨3.0 g，尿素0.33 g，NaCl 1.0 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0。

菌種鑒定培養(yǎng)基:參見(jiàn)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［9］。

Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR 9164 購(gòu)自Takara(日本);16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit RR176 購(gòu)自Takara(日本);Takara MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 購(gòu)自Takara(日本)。

1.3 分離菌株的鑒定

1.3.1 生理生化鑒定

參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［9］和《現(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》［10］進(jìn)行。

1.3.2 16S rDNA 序列測(cè)定

把AF1 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，嚴(yán)格按照Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164，Takara)操作說(shuō)明進(jìn)行操作，獲得含基因組DNA 的裂解液，然后以裂解液為模板，按Takara 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176，Takara)進(jìn)行PCR 反應(yīng)，PCR 產(chǎn)物用Takara MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0(Code No.9761，Takara)進(jìn)行回收純化。純化產(chǎn)物送Invitrogen 公司進(jìn)行全序列測(cè)序。測(cè)序引物Seq forward、Seq internal 和Seq reverse 來(lái)自于Takara 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176，Takara)。將序列通過(guò)NCBI 網(wǎng)站中的BLAST 程序與GenBank 中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，從數(shù)據(jù)庫(kù)中選取與所分析的細(xì)菌基因序列同源性較高的已知相關(guān)序列，采用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用Bootstrap 檢驗(yàn)，且Bootstrap 值為1000。

1.4 α-淀粉酶活力測(cè)定［11，12］

酶活力定義:在合適溫度下，l mL 酶液1 min 內(nèi)催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物變化0.01 個(gè)吸光值定義為1個(gè)酶活力單位。

α-淀粉酶活力測(cè)定采用碘比色改良法進(jìn)行，具體操作步驟如下:分別吸取5.0 mL 0.4%的可溶性淀粉溶液和一定pH 的0.2 mol/L 磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖溶液5.0 mL 于樣品和空白對(duì)照試管中，在一定溫度恒溫水浴中預(yù)熱平衡5 min。然后在樣品管中加入適度稀釋待測(cè)酶液2.0 mL，同時(shí)空白對(duì)照管中加入煮沸的酶液2.0 mL(或加同體積的緩沖液2.0 mL)，用秒表記錄時(shí)間，搖勻，準(zhǔn)確酶解反應(yīng)5 min 后立即吸取反應(yīng)液1.0 mL，加入到預(yù)先盛有0.5 mL 鹽酸(0.1 mol/L)和5.0 mL 稀碘液(需當(dāng)天配制，取原碘液2.0 mL，加碘化鉀20 g，加蒸餾水溶解定容至500 mL，貯于棕色瓶?jī)?nèi))的試管中，搖勻，冰浴中終止反應(yīng)，于580 nm 波長(zhǎng)下，用10 mm 比色皿迅速測(cè)定其吸光度值(OD)。以1.0 mL 水代替1.0 mL 反應(yīng)液為參比對(duì)照。

OD0為空白對(duì)照吸光度值，OD 為樣品吸光度值，2 為酶液體積(mL)，5 為反應(yīng)時(shí)間(min)。

1.5 α-淀粉酶酶液制備

將斜面菌種接種到新鮮斜面培養(yǎng)基上，37 ℃活化培養(yǎng)24 h 后，挑取1 環(huán)接種到裝有50 mL 生長(zhǎng)培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，37 ℃、200 rpm 培養(yǎng)，待OD600值達(dá)到5.0 時(shí)，按1%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 h，發(fā)酵液于12000 rpm 離心5 min，取上清液作為酶液，用于各種酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.6 α-淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1 酶反應(yīng)最適溫度測(cè)定

按照上述酶活力測(cè)定方法，保持其他條件恒定，分別在40、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃測(cè)定酶活，以溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)繪制曲線(xiàn)，得到酶反應(yīng)最適溫度。以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.6.2 酶反應(yīng)最適pH 測(cè)定

按照上述酶活力測(cè)定方法，保持其他條件恒定，分別在pH 3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、7.0、8.0 測(cè)定酶活，以pH 為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)繪制曲線(xiàn)，得到酶反應(yīng)最適pH。以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.6.3 酶的熱穩(wěn)定性

將酶液分別在50、60、70、80、90、100 ℃的條件下，分別保溫5，10、20、30、45、60 min 后，迅速置于冰水中冷卻后，在上述確定的最適反應(yīng)溫度和pH條件下測(cè)定剩余酶活。以保溫時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)，繪制曲線(xiàn)。以未處理的原酶液的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.6.4 酶的pH 穩(wěn)定性

用磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液將酶液調(diào)pH 分別為4.0、4.6、5.0、6.0、7.0、8.0，放置5、10、20、30、45、60 min 后，調(diào)節(jié)pH 至最適反應(yīng)pH 值，再測(cè)酶活。

在上述確定的最適反應(yīng)溫度和pH 條件下測(cè)定剩余酶活。以保溫時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)，繪制曲線(xiàn)。以未處理的原酶液的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.6.5 金屬離子對(duì)酶穩(wěn)定性影響

分別配制10 mmol/L 的Na+、K+、Li+、Ba2+、Fe3+、Ca2+、Mg2+、Cu2+，EDTA 共九種離子的母液。取酶液，分別加入不同離子母液，得到金屬離子終濃度2.5 mmol/L 的酶液，在室溫放置60 min 后，在上述確定的最適反應(yīng)溫度和pH 條件下測(cè)定酶活。觀察不同金屬離子作用下的剩余酶活，以不含金屬離子的原酶液的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)特征

菌株AF1 在LB 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，形成圓形菌落，乳白色，不透明，表面干燥粗糙，有隆起，邊緣不規(guī)則。菌體形態(tài)為桿狀、單生，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，芽孢呈橢圓形，端生(見(jiàn)圖1)。

圖1 AF1 的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological characteristics of AF1 cells

2.1.2 生理生化特征

生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。綜合供試菌株AF1的形態(tài)特征及生理生化特性，《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中相應(yīng)屬、種的有關(guān)性狀，可將AF1 菌歸入芽孢桿菌屬(Bacillus)。

表1 菌株AF1 生理生化特征Table 1 Biochemical and physiological characteristics of strain AF1

2.1.3 16S rDNA 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

AF1 的16S rDNA 的基因全序列長(zhǎng)度為1475 bp，在GenBank 中的登錄號(hào)為:KM373520。將獲得的基因序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast 同源性比對(duì)分析，結(jié)果表明，AF1 的16S rDNA 序列與許多Bacillus amyloliquefaciens 和Bacillus subtilis 相似性均為99%。從中選取部分同源性較高的菌種，用MEGA 6.0 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)AF1 與Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum FZB42 聚在一個(gè)進(jìn)化分支上，如圖2。

圖2 菌株AF1 16S rDNA 全序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic neighbor-joining tree based on 16S rDNA sequence of strain AF1

綜合上述AF1 菌株的形態(tài)、生理生化特征，以及16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析，確定AF1 菌株為芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

2.2 α-淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 酶反應(yīng)最適溫度

圖3 溫度對(duì)酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on α-amylase activity

在不同溫度條件下，pH 5.0 時(shí)測(cè)定α-淀粉酶活力。如圖3 顯示，此菌株的α-淀粉酶反應(yīng)的最適溫度是75 ℃，在55～80 ℃之間相對(duì)酶活較高，在40～75 ℃范圍內(nèi)酶活力隨溫度上升而升高，75 ℃時(shí)酶活力達(dá)到最高，隨后酶活力隨溫度上升而下降。

2.2.2 酶反應(yīng)最適pH

在不同pH 條件下，75 ℃時(shí)測(cè)定α-淀粉酶的活力。如圖4 所示，菌株AF1 所產(chǎn)的α-淀粉酶的活力受酸堿度影響較大，在偏酸條件下酶活力較高。其最適pH 為5.0，在pH 4.5～6.5 之間，相對(duì)酶活在80%以上。

圖4 pH 對(duì)酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on α-amylase activity

2.2.3 酶熱穩(wěn)定性研究

酶液在不同溫度保溫不同時(shí)間后測(cè)定酶液活力，結(jié)果見(jiàn)圖5。在1 h 內(nèi)，60 ℃以下，該酶相對(duì)比較穩(wěn)定，剩余酶活力80%以上，而70 ℃以上，酶活力下降很快，到80 ℃時(shí)，保溫僅30 min，剩余酶活力為0。

圖5 溫度對(duì)酶的穩(wěn)定性影響Fig.5 Effect of temperature on enzyme stability

2.2.4 酶pH 穩(wěn)定性

將酶液用不同pH 的緩沖液處理不同時(shí)間后，測(cè)定各剩余酶活，結(jié)果如圖6 所示。該酶在pH 5.0～7.0 處理1 h 后，剩余酶活≥80%，非常穩(wěn)定。在pH≤4.6 和pH≥8.0 時(shí)，處理1 h 后，剩余酶活則不足50%。

圖6 pH 對(duì)酶的穩(wěn)定性影響Fig.6 Effect of pH on enzyme stability

圖7 金屬離子對(duì)酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of metal ions on enzyme stability

2.2.5 金屬離子對(duì)酶的穩(wěn)定性影響

取酶液，分別加入一定濃度的不同離子母液，得到金屬離子終濃度2.5 mmol/L 的酶液，在室溫放置60 min 后測(cè)定酶活，結(jié)果見(jiàn)圖7。Cu2+對(duì)酶活有明顯的抑制作用，酶活力降至76%;K+、Li+、Fe3+則對(duì)酶活有輕微抑制作用，只降低10%左右;而其他金屬離子Na+、Ca2+、Ba2+、Mg2+和EDTA 則對(duì)酶活沒(méi)有明顯的影響。

3 討論

當(dāng)代淀粉加工業(yè)中，α-淀粉酶在pH 6.8，Ca2+穩(wěn)定的條件下發(fā)揮活性，而天然淀粉的pH 為3.2～4.5 之間，所以為了適合α-淀粉酶的最適pH，首先得將淀粉溶液的pH 提高到5.8～6.2，而且要添加Ca2+去維持酶的穩(wěn)定性。這些步驟降低了生產(chǎn)效率和增加了成本，因此，耐酸性α-淀粉酶的研究和開(kāi)發(fā)具有重要意義［8］。現(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外所篩選到的產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的菌株主要為芽孢桿菌和曲霉，如酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(B.acidocaldarius)A-2［13］，酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(B.acidocaldarius)ATCC2709［14，地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)［15］，黑曲霉(Aspergillus niger)［16］，白曲霉(Aspegillus kawachii)［17］，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus steorothermopilius)［18］等，最適pH 4.5～5.5 之間，最適溫度在30～60 ℃之間［19］，但初始酶活力均不高，且某些缺乏可靠的安全性，無(wú)法滿(mǎn)足實(shí)際生產(chǎn)的需要。本文中AF1 菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefacien)，是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌，對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害，不污染環(huán)境。AF1 菌株產(chǎn)生的α-淀粉酶最適作用溫度為75 ℃，比常見(jiàn)的α-淀粉酶最適溫度在30～60 ℃之間要高一些，可以降低淀粉從糊化到液化的冷卻過(guò)程中大量的冷量損耗，還可以增加液化速度。AF1 的耐酸性α-淀粉酶最適反應(yīng)pH 為5.0，與淀粉加工過(guò)程中的糖化酶偶聯(lián)作用，可避免pH的調(diào)節(jié)，從而精簡(jiǎn)工序，節(jié)約成本。該酶在pH 5.0～7.0 范圍內(nèi)酶活比較穩(wěn)定，Cu2+對(duì)酶活有明顯的抑制作用，Na+，Ca2+，Ba2+，Mg2+和EDTA 則對(duì)酶活沒(méi)有明顯的影響。目前，工業(yè)上所用的商品化α-淀粉酶多數(shù)需要依賴(lài)Ca2+來(lái)維持穩(wěn)定性和活性，但是高果糖漿生產(chǎn)工藝中的Ca2+會(huì)抑制葡萄糖異構(gòu)酶的作用［4，5］，因此，開(kāi)發(fā)不依賴(lài)Ca2+的α-淀粉酶具有更好的發(fā)展前景。目前國(guó)內(nèi)外已有部分研究者選育篩選了不依賴(lài)Ca2+的α-淀粉酶菌株［20-22］，本研究中的α-淀粉酶是一種不依賴(lài)于Ca2+的耐酸性α-淀粉酶，在淀粉加工過(guò)程中，不僅不用加Ca2+以維持酶的活性，同時(shí)可以將其與糖化酶偶聯(lián)作用，避免pH調(diào)節(jié)，能夠?qū)崿F(xiàn)在弱酸性條件下淀粉液化和糖化同步進(jìn)行，從而精簡(jiǎn)工序，節(jié)約成本。

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